機(jī)械擠壓法制備的納米囊泡對(duì)比自然分泌的胞外囊泡：形態(tài)及組分

細(xì)胞外囊泡(EV)是細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層包裹的顆粒。這些細(xì)胞來(lái)源的天然EV (natural EV, nEV)可用作藥物載體來(lái)遞送藥物。與膠束、脂質(zhì)體、聚合物納米顆粒相比，nEV作為天然的遞送系統(tǒng)，具有低免疫原性。還可與受體細(xì)胞膜融合，避開(kāi)溶酶體吞噬，將藥物直接輸送到細(xì)胞質(zhì)中，從而提高蛋白、核酸藥物的輸送效率。此外，干細(xì)胞分泌的nEV攜帶有母體干細(xì)胞的蛋白、核酸，目前也被嘗試用于組織修復(fù)和再生。

nEV用于藥物遞送及組織修復(fù)再生的前景良好，但nEV的自然產(chǎn)率極低。為了獲得足夠數(shù)量的nEV，需要大量的細(xì)胞和較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期，導(dǎo)致高生產(chǎn)成本，進(jìn)而影響相關(guān)臨床轉(zhuǎn)化。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)破壞細(xì)胞（如機(jī)械擠壓、超聲、凍融等處理），可獲得納米尺寸的，外觀及結(jié)構(gòu)類似于nEV的囊泡（cell-derived nanovesicles, CNV）。但CNV的產(chǎn)率是nEV的50-100倍，生產(chǎn)成本不到nEV的10%。

作為nEV的廉價(jià)替代品，CNV在藥物遞送和再生醫(yī)學(xué)中的作用也已得到證實(shí)。但一個(gè)基本問(wèn)題尚未被確認(rèn)，即CNV和nEV到底有多相似？

現(xiàn)有研究?jī)H僅證明兩者都是納米級(jí)的脂質(zhì)雙層封閉囊泡，都攜帶經(jīng)典的EV蛋白標(biāo)記物。但兩者攜帶的蛋白、核酸有多相似，還未有相關(guān)研究。

近日，賓漢姆頓大學(xué)萬(wàn)源和南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院毛文君課題組，在ELSEVIER旗下的學(xué)術(shù)期刊Extracellular Vesicle上發(fā)表文章，研究者基于高通量測(cè)序?qū)烧叩牡鞍准靶?/span>RNA（small RNA， smRNA）進(jìn)行了比較。

同過(guò)往研究結(jié)論一樣，該研究證實(shí)nEV和CNV在大小并無(wú)區(qū)別，蛋白印跡也發(fā)現(xiàn)兩者都攜帶經(jīng)典EV蛋白標(biāo)志物。一些參與免疫調(diào)節(jié)的蛋白，如CD55, CD44, CD5，MHC-I等，均在兩者中檢測(cè)到。

nEV的排他性標(biāo)志物，如細(xì)胞色素C，鈣聯(lián)結(jié)蛋白，組蛋白，在nEV中檢測(cè)不到。擠壓獲得的CNV攜帶有微量細(xì)胞色素C，但未見(jiàn)鈣聯(lián)結(jié)蛋白和組蛋白。后續(xù)的蛋白質(zhì)譜分析中也為發(fā)現(xiàn)鈣聯(lián)結(jié)蛋白和組蛋白。

蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞來(lái)源的CNV和nEV，總蛋白（膜蛋白及包裹在囊泡內(nèi)的蛋白）的近似度約21%。需要提醒的是，在比較蛋白表達(dá)近似度時(shí)，一般認(rèn)為~60%近似度即有高度相似性。nEV組內(nèi)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品之間的近似度分別為66%，而CNV的組內(nèi)樣品間近似度則有79%。接著課題組培養(yǎng)9個(gè)不同腫瘤細(xì)胞系，并分別收集了nEV和CNV。利用核酸標(biāo)記的抗體結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)，來(lái)定性定量檢測(cè)181種囊泡膜蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，181種膜蛋白在nEV與CNV之間的近似度有71%。

二代測(cè)序比較了兩組間smRNA的表達(dá)差異。單單比較smRNA種類，nEV和CNV近似度超過(guò)95%。接著對(duì)nEV和CNV中前1000個(gè)smRNAs表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這1000個(gè)smRNA在兩組之間有65%的相似性。nEV組內(nèi)五個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品之間的批次間差異為5.4%，CNV組內(nèi)批次間差異為9.3%。

結(jié)合以上結(jié)果，研究人員推斷當(dāng)CNV用作藥物載體時(shí)，其內(nèi)部蛋白會(huì)被清空，被藥物取代，但膜蛋白可被保留?；?/span>CNV和nEV有高度近似的膜蛋白組分，CNV可能較好替代nEV用于載藥。當(dāng)CNV用于組織修復(fù)再生時(shí)，21%的總蛋白近似度及65%的smRNA近似度，也提示CNV具有可觀的生物學(xué)活性。該研究結(jié)論大體證實(shí)了過(guò)往研究報(bào)道的的CNV可用于載藥及組織修復(fù)再生。