RRBS等揭示基因突變通過DNA甲基化加劇順鉑誘導(dǎo)腎毒性

順鉑（cisplatin）是一種廣泛使用的化療藥物，但其使用常伴隨著包括腎毒性在內(nèi)的多種副作用。急性腎損傷 （Acute kidney injury，AKI）是與順鉑治療相關(guān)的常見不良反應(yīng)之一,約30%患者因順鉑的腎毒性而中斷治療。

異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）的亞型IDH1在維持細(xì)胞氧化狀態(tài)的氧化還原平衡中起著重要作用，IDH1-R132H突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但順鉑是否會(huì)在攜帶IDH1-R132H突變的個(gè)體中引起更嚴(yán)重的腎毒性尚不清楚。深入探究順鉑誘導(dǎo)的腎毒性機(jī)制，并研究IDH1-R132H突變是否通過影響線粒體氧化應(yīng)激加劇順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷，從而促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷（Cis-AKI）發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要。

近日，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科賴?yán)っ啦┦康葹榈谝蛔髡?，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科許艷芳教授和中國(guó)香港科學(xué)園腫瘤學(xué)及免疫學(xué)中心Tak W. Mak為共同通訊，本研究結(jié)果揭示IDH1-R132H突變加劇了腎小管中線粒體脂質(zhì)過氧化和功能障礙，使腎臟更容易受到順鉑誘導(dǎo)的鐵死亡影響。IDH1-R132H突變?cè)黾覰dufa1啟動(dòng)子甲基化，從而抑制NDUFA1的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這種抑制破壞了NDUFA1與FSP1的相互作用，降低了其對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡的抵抗力。進(jìn)而導(dǎo)致活性氧（ROS）積累、脂質(zhì)過氧化發(fā)生，促進(jìn)鐵死亡，從而引發(fā)急性腎損傷。

總之，這項(xiàng)研究闡明了順鉑誘導(dǎo)的腎毒性新機(jī)制，并為攜帶IDH1-R132H突變的腫瘤患者個(gè)性化治療策略發(fā)展提供了寶貴見解。 研究方法 動(dòng)物模型建立：使用特異性突變的IDH1在腎小管中（Idh1WT/WTKspCre）的小鼠模型，與Idh1WT/WTKspCre組進(jìn)行比較，通過腹腔注射順鉑建立Cis-AKI模型。

細(xì)胞活性和細(xì)胞死亡評(píng)估：評(píng)估順鉑處理后腎小管上皮細(xì)胞（PTCs）的活性和死亡。

氧化應(yīng)激和線粒體ROS的測(cè)量：使用DCFH-DA和MitoSOX等熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體ROS。

脂質(zhì)過氧化、線粒體形態(tài)和線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)：評(píng)估順鉑處理后腎臟組織的脂質(zhì)過氧化水平和線粒體功能。

免疫共沉淀和鄰位連接（PLA）實(shí)驗(yàn)：分析NDUFA1和FSP1之間的直接相互作用。 CRISPR-Cas9技術(shù)：敲除Ndufa1和Fsp1基因以研究其在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。

簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）：用于分析IDH1-R132H突變對(duì)腎臟DNA甲基化模式和基因表達(dá)的影響。

作者假設(shè)腎小管中的IDH1-R132H突變可能會(huì)改變與線粒體相關(guān)基因的甲基化模式，從而加劇順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷。RRBS測(cè)序分析結(jié)果揭示在Idh1WT/MutKspCre小鼠腎臟的外顯子區(qū)域有15296個(gè)上調(diào)和7947個(gè)下調(diào)的差異甲基化基因，而在啟動(dòng)子區(qū)域觀察到12935個(gè)上調(diào)和4409個(gè)下調(diào)的差異甲基化基因（以Idh1WT/WTKspCre小鼠作為對(duì)照組）。

基因富集分析表明啟動(dòng)子區(qū)域與組蛋白乙?；?、細(xì)胞代謝和氧化磷酸化相關(guān)的信號(hào)被激活。在上調(diào)的甲基化位點(diǎn)中，與線粒體呼吸鏈組裝相關(guān)基因Ndufa1的啟動(dòng)子區(qū)域觀察到增強(qiáng)的甲基化。進(jìn)一步的亞硫酸鹽測(cè)序PCR（BSP）結(jié)果與RRBS測(cè)序一致。Ndufa1啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域位于chrX:37191032-37191910區(qū)域，包含74個(gè)CpG位點(diǎn)。在體外實(shí)驗(yàn)中，Idh1WT/WT組中Ndufa1區(qū)域的CpG位點(diǎn)約有47.4%被甲基化，而在Idh1WT/Mut組中，約有82.4%的CpG位點(diǎn)被甲基化。在Idh1WT/WTKspCre小鼠的腎臟組織中，Ndufa1區(qū)域約有54%的CpG位點(diǎn)甲基化，而在Idh1WT/MutKspCre組中，約有80%的CpG位點(diǎn)甲基化。腎臟組織和體外PTCs的QT-PCR和western blot分析表明NDUFA1的表達(dá)水平降低。為了測(cè)試CpG甲基化是否在Ndufa1基因轉(zhuǎn)錄抑制中起直接作用，作者進(jìn)行了MSssI的補(bǔ)丁甲基化實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合熒光素酶活性檢測(cè)。分析結(jié)果表明CpG甲基化抑制了Ndufa1基因啟動(dòng)子活性，并在沉默Ndufa1中起直接作用。CpG位點(diǎn)甲基化由IDH1-R132H調(diào)控。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了由于IDH1-R132H突變引起的甲基化水平上調(diào)，導(dǎo)致Ndufa1的轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制。

本研究結(jié)果表明IDH1-R132H突變通過增加Ndufa1啟動(dòng)子甲基化，抑制NDUFA1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，破壞NDUFA1與FSP1互作，從而影響FSP1在線粒體中的定位及其將CoQ還原為CoQH2的能力，導(dǎo)致ROS和脂質(zhì)過氧化物積累，進(jìn)而加劇順鉑誘導(dǎo)的氧化損傷和鐵死亡在腎小管上皮細(xì)胞中的發(fā)生。

研究亮點(diǎn) 揭示鐵死亡和氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián)：研究強(qiáng)調(diào)了鐵死亡在順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用，并揭示了NDUFA1-FSP1軸在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中的重要性。

提示新分子機(jī)制：本研究揭示了IDH1-R132H突變通過表觀遺傳機(jī)制影響線粒體功能，進(jìn)而影響腎臟對(duì)順鉑的響應(yīng)。 提供個(gè)性化治療策略：研究結(jié)果為攜帶IDH1-R132H突變的腫瘤患者提供了個(gè)性化治療策略的寶貴見解。