抗HCV中和抗體的研究進(jìn)展

【關(guān)鍵詞】  丙型肝炎病毒;,中和抗體;,假病毒

　　[關(guān)鍵詞]丙型肝炎病毒; 中和抗體; 假病毒

　　丙型肝炎病毒（HCV）為具包膜的單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒家族。HCV是已知惟一能造成慢性感染的RNA病毒（除逆轉(zhuǎn)錄病毒外）, 據(jù)估計(jì), 目前全球約1.7億HCV感染者中, 60%~80%為慢性攜帶者, 而持續(xù)性感染終發(fā)展為肝硬化/肝癌的機(jī)率高達(dá)3.5%～20%[1]。如此高比例的慢性感染率意味著在可能的病毒免疫逃逸機(jī)制下, 機(jī)體往往無(wú)法激發(fā)或維持有效的抗病毒免疫反應(yīng)。而對(duì)于急性感染中一小部分能形成自限性感染的機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制現(xiàn)在還不十分清楚,但有越來(lái)越多的證據(jù)表明, 細(xì)胞免疫在其中發(fā)揮主要作用, 即在感染早期建立針對(duì)多個(gè)HCV抗原表位、 多特異性的CD8+ CTL和CD4+ Th強(qiáng)細(xì)胞免疫屏障, 對(duì)于急性感染的控制與病毒清除至關(guān)重要[2]。然而, 作為獲得性免疫的道防線, 體液免疫尤其是中和抗體在阻斷HCV感染和免疫清除中的作用, 長(zhǎng)久以來(lái)一直困于沒(méi)有簡(jiǎn)易有效的檢測(cè)與評(píng)價(jià)手段而所知甚少, 有限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間也往往彼此相左。近兩年, 隨著HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型和以慢病毒載體為基礎(chǔ)的HCV假病毒模型的建立與成功運(yùn)用, 這一領(lǐng)域成為新的研究熱點(diǎn)。

　　1  HCV包膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

　　HCV基因組長(zhǎng)約9.6 kb, 編碼一個(gè)長(zhǎng)約3000個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白前體, 在宿主信號(hào)肽酶和病毒自身編碼蛋白酶的作用下生成4種結(jié)構(gòu)蛋白（C、 E1、 E2、 p7）和6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2NS5B）, 其中E1、 E2為包膜糖蛋白, 是中和抗體的主要靶抗原。E1和E2都屬于I型整合膜蛋白, 包括一個(gè)較大的N端膜外區(qū)和一個(gè)C端疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域。在其各自N端上游信號(hào)肽的引導(dǎo)下, 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上完成高度的N糖基化, 并被宿主信號(hào)肽酶切割后, 非共價(jià)結(jié)合形成成熟的異源二聚體滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 在病毒萌出時(shí)與膜結(jié)構(gòu)一同包裹在病毒表面。E1/E2的這種天然構(gòu)象與修飾對(duì)于HCV的感染性是非常重要的[3]。 E區(qū)是整個(gè)HCV基因組中變異大的部分, 尤其是位于E2蛋白N端的約27個(gè)殘基, 即HVR1（hypervariable region 1）。迄今為止, 每一次分離得到的HCV病毒, 該高變區(qū)序列均不相同。多數(shù)研究表明, HCV HVR1是中和抗體的重要靶位點(diǎn), 內(nèi)含數(shù)個(gè)線形表位和一個(gè)部分構(gòu)象限制性表位。但是抗原性區(qū)域的高變性也使得在宿主免疫壓力的選擇下, 新出現(xiàn)的突變株可以不斷逃逸針對(duì)此前優(yōu)勢(shì)株HVR1抗體的中和作用, 成為導(dǎo)致HCV慢性感染中免疫逃逸的重要原因之一[4]。同時(shí), 近有研究顯示, HVR1還可能通過(guò)模擬免疫球蛋白IgG可變區(qū)的結(jié)構(gòu), 偽裝成宿主自身抗原, 從而達(dá)到逃避體液免疫識(shí)別的目的[5]。有趣的是, 缺失HVR1的重組HCV病毒同樣具有感染性并且仍然可以在黑猩猩模型上造成持續(xù)性感染, 但是其毒力明顯減弱且子代病毒在繼發(fā)傳染中再不能建立慢性感染[6]。這些結(jié)果也表明, HVR1在HCV包膜蛋白介導(dǎo)的病毒侵入過(guò)程中發(fā)揮了重要作用, 但并非是必須的, 提示我們?cè)贓1/E2蛋白上還存在其他的中和表位, 尤其是與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的部位, 由于其具有重要的生物學(xué)功能, 因此必然具有一定的保守性, 對(duì)這些保守性中和表位的研究意義重大。目前對(duì)HCV受體及其與HCV包膜蛋白的相互作用仍所知有限。已知可能的受體分子包括四跨膜蛋白家族成員CD81, B族I型清道夫受體（SRBI）, 低密度脂蛋白受體（LDLR）以及甘露糖結(jié)合凝集素LSIGN和DCSIGN, 而E2則是與他們直接相互作用的亞單位。其中, 體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)業(yè)已證實(shí)CD81和SRBI在HCV侵入過(guò)程中發(fā)揮著直接作用, E2蛋白上和他們相互作用的位點(diǎn)信息也被逐漸確認(rèn), 針對(duì)這些位點(diǎn)的單克隆抗體（mAb）往往具有中和活性[7]。然而, 在非肝源性細(xì)胞系中共表達(dá)CD81和SRBI并不能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)HCV的易感性, 說(shuō)明在肝細(xì)胞表面很可能還存在著為HCV侵入所必須的其他受體分子。對(duì)HCV受體和病毒侵入機(jī)制的進(jìn)一步研究對(duì)于HCV疫苗和特異性藥物的研制具有重要意義。

　　2  中和抗體檢測(cè)與評(píng)估的方法 

　　一般而言, 中和抗體是指在細(xì)胞培養(yǎng)或動(dòng)物模型中具有抑制病毒感染能力的保護(hù)性抗體; 通過(guò)自然感染或人工免疫途徑所建立的中和抗體反應(yīng)是抗病毒免疫保護(hù)的重要組成部分。然而, 由于黑猩猩是迄今為止惟一可靠的HCV易感動(dòng)物模型, 而穩(wěn)定的HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)直至近才基本建立, 缺乏簡(jiǎn)易有效的檢測(cè)與評(píng)價(jià)手段長(zhǎng)久以來(lái)一直是阻礙HCV中和抗體定性與定量研究的主要原因。基于黑猩猩動(dòng)物模型的體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)與基于T淋巴細(xì)胞半復(fù)制子模型的體外中和實(shí)驗(yàn)[8], 在將近10年的早期研究中一直作為僅有的直接檢測(cè)手段, 為認(rèn)識(shí)HCV中和抗體反應(yīng)打下了重要的基礎(chǔ), 但是材料的局限性和操作的復(fù)雜性妨礙了他們的廣泛應(yīng)用。人們一直致力于發(fā)展更為簡(jiǎn)易可靠的體外中和實(shí)驗(yàn)方法, 并獲得了一定的進(jìn)展。早發(fā)展起來(lái)的方法包括檢測(cè)抗體對(duì)膜蛋白E2與靶細(xì)胞（如MOLT4細(xì)胞系）結(jié)合的抑制作用, 即結(jié)合中和（neutralization of binding, NOB）實(shí)驗(yàn)[9], 或者檢測(cè)抗體在HCV對(duì)單核細(xì)胞的感染或與成纖維細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程中的抑制作用[10]。這些方法往往只是間接反映中和作用的強(qiáng)度, 很難準(zhǔn)確定量。由桿狀病毒載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的HCV病毒樣顆粒（VLP）可以模擬HCV病毒粒子的天然結(jié)構(gòu)[11]; 構(gòu)建能表達(dá)去除了C端跨膜區(qū)的E1/E2蛋白的假型水皰性口炎病毒（VSV）或假型流感病毒,將修飾后的E1/E2表達(dá)到相應(yīng)病毒的包膜表面, 可以與相應(yīng)的受體結(jié)合從而具有與HCV相似的細(xì)胞嗜性[12]。但是無(wú)論是VLP還是假型VSV/HCV病毒, 其感染性都非常低甚至沒(méi)有感染性, 因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定有時(shí)彼此矛盾, 阻礙了他們?cè)谘芯縃CV細(xì)胞侵入過(guò)程以及定量中和中的應(yīng)用。根據(jù)Naldini等[13]于1996年發(fā)展的3種質(zhì)粒（包裝質(zhì)粒、 轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒、 包膜質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒載體（lentiviral vector）的技術(shù), 2003年, Cosset FL實(shí)驗(yàn)室利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的兩個(gè)重要特性（可插入外源糖蛋白; 復(fù)制缺陷的病毒顆?？烧喜⒈磉_(dá)標(biāo)記基因）, 構(gòu)建攜帶完整的HCV E1與E2包膜糖蛋白的表達(dá)質(zhì)粒, 制備感染性的HCV假型包膜病毒顆粒。該假型病毒模型的包膜蛋白源于完整的HCV包膜糖蛋白, 且該病毒可感染肝源性的傳代細(xì)胞（如Huh7）或原代肝細(xì)胞。一旦病毒感染細(xì)胞后, 轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒中標(biāo)記基因（如EGFP、 LUC或βGAL等）的表達(dá)可直接便捷地觀察到, 因此可將其發(fā)展為一種篩選HCV受體結(jié)合分子的方法, 同時(shí)亦可發(fā)展為一種體外中和抗體的檢測(cè)手段, 對(duì)HCV感染的體液免疫應(yīng)答及中和抗體的產(chǎn)生進(jìn)行研究。一系列的研究結(jié)果表明: ①HCV假型顆粒呈現(xiàn)出嗜肝性且可被抗E2的mAb或HCV患者血清中和, 可用作研究HCV感染早期特性（如宿主嗜性、 受體結(jié)合、 膜融合及血清中和等）的有效模型; ②在慢性HCV患者中可檢測(cè)到中和抗體的存在, 除了在HCV的HVR1高變區(qū)存在一個(gè)中和位點(diǎn)外, 其他區(qū)域亦可能存在中和表位, 且該類中和抗體有廣譜反應(yīng)性; ③該體外中和實(shí)驗(yàn)方法所獲得的結(jié)果與早先建立了體內(nèi)中和（黑猩猩模型）或體外中和（淋巴細(xì)胞系）實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致, 基于假型包膜病毒感染模型的體外中和試驗(yàn)敏感、 特異、 重復(fù)性好、 可定量、 易于操作[14]。近來(lái), 隨著完整的HCV全細(xì)胞培養(yǎng)模型的基本建立, 使得體外穩(wěn)定高效的獲得感染性病毒顆粒并用于中和抗體的檢測(cè)與評(píng)價(jià)成為可能。但是, 由于操作此類HCV感染性活病毒必須在BSL3級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室條件下, 在一定程度上限制了這種方法的運(yùn)用。因此, 利用上述相對(duì)安全的HCV假病毒模型是目前為經(jīng)濟(jì)有效的手段。事實(shí)上, 假病毒技術(shù)正發(fā)展成為一種研究高危病毒（如SARS病毒、 埃博拉病毒和禽流感病毒等）的有效手段。

　　3  中和抗體在HCV抗感染免疫中的作用

　　眾所周知, 體液免疫尤其是以中和抗體為主的保護(hù)性抗體, 在阻斷病毒感染、 抑制病毒復(fù)制的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用, 從而為細(xì)胞免疫終清除病毒及感染細(xì)胞創(chuàng)造了條件。但是, 人們對(duì)于中和抗體在抗HCV感染免疫中的作用卻知之甚少且充滿爭(zhēng)議。早期的臨床研究顯示, 自然感染過(guò)程中機(jī)體所激發(fā)的免疫力不足以產(chǎn)生對(duì)HCV的完全保護(hù), 大部分急性感染者發(fā)展為慢性攜帶。而初始感染自愈的病人即使體內(nèi)存在較高水平的抗包膜蛋白特異性抗體, 對(duì)繼發(fā)感染也沒(méi)有完全的保護(hù)作用; 另一方面, 部分自限性感染者的急性恢復(fù)與病毒清除可以在未生成抗HCV抗體及不發(fā)生血清轉(zhuǎn)化的情況下由細(xì)胞免疫完成[15]。黑猩猩動(dòng)物模型中也重復(fù)了同樣的結(jié)果[16]。這些研究提示, 體液免疫在HCV自然感染過(guò)程中可能不起主要保護(hù)作用。進(jìn)一步的免疫攻擊實(shí)驗(yàn)表明, 用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組HCV包膜蛋白免疫可以保護(hù)黑猩猩抵抗低劑量的同株病毒攻擊, 但是對(duì)于異株病毒攻擊卻沒(méi)有明顯的保護(hù)作用[17]。使用HVR1合成肽免疫黑猩猩也獲得了類似的結(jié)果[18]。同時(shí), 由于HVR1抗血清可以在黑猩猩模型和細(xì)胞模型上中和同源病毒的感染性, 因此HVR1被視為中和抗體的主要靶點(diǎn), 有研究表明, 能否在感染早期誘導(dǎo)抗HVR1抗體可能與急性感染的恢復(fù)相關(guān)[19]。但是, 由于HVR1處于宿主免疫壓力之下, 通過(guò)不斷變異來(lái)逃逸機(jī)體內(nèi)此前優(yōu)勢(shì)株抗體的中和作用, 這是HCV免疫逃逸引起慢性感染的重要機(jī)制。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí), 患者體內(nèi)HVR1序列的變化可以預(yù)測(cè)感染及治療后的轉(zhuǎn)歸。序列變異程度越大、 準(zhǔn)種復(fù)雜程度越高則干擾素療效越差,發(fā)展為慢性感染的幾率越高[20]。這些結(jié)果提示, 針對(duì)HVR1的中和抗體在HCV感染過(guò)程中的保護(hù)作用非常有限。近年來(lái), 隨著研究的深入, 人們對(duì)HCV免疫保護(hù)的范疇有了新的認(rèn)識(shí)。因?yàn)镠CV急性感染多數(shù)表現(xiàn)為無(wú)癥狀無(wú)病理?yè)p傷狀態(tài), 僅伴隨著血清中病毒RNA和轉(zhuǎn)氨酶的一過(guò)性升高, 而持續(xù)性感染才是導(dǎo)致丙型肝炎各種慢性病理反應(yīng)的元兇, 因此采用預(yù)防慢性感染作為免疫保護(hù)的重要指標(biāo)而非早期所采用的預(yù)防急性感染的能力（即消除性免疫力）似乎更為合理。從這個(gè)層面上, 人們發(fā)現(xiàn)在先前的臨床實(shí)驗(yàn)與黑猩猩模型中, 盡管初始感染并不能防止繼發(fā)感染, 但是大多數(shù)僅僅表現(xiàn)為短暫的遠(yuǎn)低于初次感染時(shí)的病毒血癥并隨即從急性感染中恢復(fù); 而免疫攻擊實(shí)驗(yàn)則表明, 雖然重組HCV包膜蛋白免疫后并不能獲得對(duì)HCV的完全保護(hù), 大多數(shù)黑猩猩卻能很快地清除病毒, 不會(huì)發(fā)展為慢性感染, 無(wú)論使用同源還是異源的病毒株攻擊。同時(shí), 這種保護(hù)作用與能阻斷E2蛋白與其受體CD81或易感細(xì)胞結(jié)合的抗體滴度相關(guān), 而與HVR1抗體無(wú)關(guān)[21]。這些結(jié)果使得研究者開(kāi)始重新評(píng)價(jià)中和抗體在抗感染免疫中的作用及其與體液免疫保護(hù)之間的關(guān)系。由于HCV假病毒模型的出現(xiàn)解決了長(zhǎng)久以來(lái)缺乏簡(jiǎn)易可靠的體外中和試驗(yàn)的阻礙, 人們?cè)谶@一領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究。首先, 證實(shí)了除HVR1之外, 其下游還存在數(shù)個(gè)中和表位, 該類中和表位可能位于同宿主細(xì)胞受體結(jié)合的區(qū)域或是對(duì)包膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要的部位, 具有一定的保守性; 所誘導(dǎo)的中和抗體在體外實(shí)驗(yàn)中能中和多株不同亞型的假型HCV病毒, 具有廣譜交叉中和活性。其次, HCV感染者尤其是慢性感染者體內(nèi)可檢測(cè)到廣譜交叉反應(yīng)中和抗體, 來(lái)自慢性感染者的血清或用其制備的免疫球蛋白通過(guò)被動(dòng)免疫可以預(yù)防HCV感染; 對(duì)于臨床用血制品的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查也支持這一結(jié)果[22]。為了進(jìn)一步分析中和抗體在控制HCV病毒復(fù)制與免疫清除中的作用, 通過(guò)比較從急性感染中恢復(fù)的自愈患者和終發(fā)展為持續(xù)性感染的慢性患者體內(nèi)中和抗體的產(chǎn)生及變化差異, 研究者發(fā)現(xiàn), 廣譜交叉反應(yīng)中和抗體的產(chǎn)生是一個(gè)緩慢的過(guò)程, 很難在感染早期或急性恢復(fù)期誘導(dǎo), 往往要在病毒復(fù)制相對(duì)穩(wěn)定的慢性感染期才能檢測(cè)到; 而此時(shí)病毒已經(jīng)成功逃逸了宿主細(xì)胞免疫的清除, 之后所產(chǎn)生的中和抗體更可能是機(jī)體對(duì)T細(xì)胞免疫不足的代償性反應(yīng)[23], 它們的存在對(duì)控制慢性感染者體內(nèi)病毒的復(fù)制、 減緩疾病的進(jìn)程以及降低病毒的傳染力可能起到了一定的作用。這些結(jié)果也提示我們, HCV在急性感染過(guò)程中可能通過(guò)某種機(jī)制延緩中和抗體的產(chǎn)生直至終建立慢性感染。近有研究顯示, 少數(shù)急性感染者體內(nèi)也存在中和抗體, 且在感染進(jìn)程中的中和能力的增強(qiáng)伴隨著病人體內(nèi)病毒載量的降低, 并在很大程度上預(yù)示了患者終的轉(zhuǎn)歸[24]。綜上, 盡管中和抗體在HCV感染清除中可能并不起到主要作用, 但是通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)免疫途徑建立廣譜交叉中和抗體反應(yīng)將是HCV免疫預(yù)防策略的重要途徑, 并為HCV疫苗的研制提供了思路。

　　4  廣譜交叉中和表位的研究與設(shè)計(jì)

　　HCV基因組存在2種不同層次的變異性。目前已知的HCV序列包括至少6種基因型和70多種基因亞型; 而在同一個(gè)體中還同時(shí)存在多種序列且有同源性的HCV相似株, 即準(zhǔn)種（quasispecies）。在感染的不同階段, 準(zhǔn)種在機(jī)體的免疫壓力選擇下也發(fā)生變異。HCV的這種高度變異性及異源性是目前HCV疫苗研制所面臨的大障礙。而誘導(dǎo)廣譜交叉保護(hù)中和性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答已成為HCV疫苗研究的基本方向[25]。由于HVR1是中和抗體的重要靶位點(diǎn), 因此一直以來(lái)是疫苗研究的重要靶抗原。然而HVR1的高變性使得針對(duì)單一序列HVR1抗體難以產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。但有證據(jù)表明, HVR1內(nèi)部尤其是位于C端的某些關(guān)鍵殘基仍具有一定的保守性, 使得HVR1能夠保持相對(duì)穩(wěn)定的空間構(gòu)象和理化性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn), 具有相似保守性特征的HVR1之間還存在明顯的交叉抗原性, 而HCV感染者體內(nèi)抗HVR1抗體以及針對(duì)HVR1的mAb也都表現(xiàn)出不同程度的交叉反應(yīng)性, 可以與其他毒株的HVR1結(jié)合。利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)篩選得到了多種能模擬不同毒株HVR1抗原性的模擬表位（mimotope）, 免疫動(dòng)物獲得的抗體具有廣泛的交叉反應(yīng)活性, 這給中和抗體的研究帶來(lái)了新的提示。然而, 在黑猩猩試驗(yàn)中顯示, 這類交叉反應(yīng)抗體似乎并不具有交叉中和活性[26], 因此其可行性還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。現(xiàn)已證實(shí), 除HVR1之外HCV包膜蛋白上還存在多個(gè)中和表位。這些表位大多位于受體結(jié)合區(qū)等比較保守的部位, 針對(duì)這些表位的mAb在體外實(shí)驗(yàn)中具有廣譜交叉中和活性。然而, 此類表位多數(shù)為構(gòu)象依賴性, 由于其天然結(jié)構(gòu)不易模擬以及可變區(qū)免疫優(yōu)勢(shì)（immunodominance）的存在, 如何經(jīng)免疫途徑產(chǎn)生相應(yīng)的抗體仍是當(dāng)前疫苗研制中所面臨的重要難題[27], 或許表達(dá)去除HVR1的HCV病毒樣顆粒將是可能的方向之一。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn), 在HVR1下游附近（412-423）包含一個(gè)在已知6種HCV基因型中均高度保守的線性中和表位, 其mAb AP33能在體外中和所有6種基因型的HCV假病毒[28]。這一線性廣譜交叉中和表位為HCV預(yù)防及治療性疫苗的研制帶來(lái)了新的希望;類似的表位仍有待發(fā)現(xiàn), 并將極大地推動(dòng)HCV保護(hù)性免疫機(jī)制的研究。

　　參考文獻(xiàn):

　　[1] Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection[J]. Nat Rev Immunol, 2005, 5(3): 215-229.

　　[2] Bowen DG, Walker CM. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis C virus infection[J]. Nature, 2005, 436(7053): 946-952.

　　[3] Lindenbach BD, Rice CM. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function[J]. Nature, 2005, 436(7053): 933-938.

　　[4] Shimizu YK, Hijikata M, Iwamoto A, et al. Neutralizing antibodies against hepatitis C virus and the emergence of neutralization escape mutant viruses[J]. J Virol, 1994, 68(3): 1494-1500.

　　[5] Hu YW, Rocheleau L, Larke B, et al. Immunoglobulin mimicry by Hepatitis C Virus envelope protein E2[J]. Virology, 2005, 332(2): 538-549.

　　[6] Forns X, Thimme R, Govindarajan S, et al. Hepatitis C virus lacking the hypervariable region 1 of the second envelope protein is infectious and causes acute resolving or persistent infection in chimpanzees[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(24): 13318-13323.

　　[7] Bartosch B, Vitelli A, Granier C, et al. Cell entry of hepatitis C virus requires a set of coreceptors that include the CD81 tetraspanin and the SRB1 scavenger receptor[J]. J Biol Chem, 2003, 278(43):  41624-41630.

　　[8] Farci P, Alter HJ, Wong DC, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibodymediated in vitro neutralization[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(16): 7792-7796.

　　[9] Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(5): 1759-1763.

　　[10] Zibert A, Schreier E, Roggendorf M. Antibodies in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis C virus can block viral attachment[J]. Virology, 1995, 208(2): 653-661.

　　[11] Baumert TF, Ito S, Wong DT, et al. Hepatitis C virus structural proteins assemble into viruslike particles in insect cells[J]. J Virol, 1998, 72(5): 3827-3836.

　　[12] Lagging LM, Meyer K, Owens RJ, et al. Functional role of hepatitis C virus chimeric glycoproteins in the infectivity of pseudotyped virus[J]. J Virol, 1998, 72(5): 3539-3546.

　　[13] Naldini L, Blomer U, Gallay P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science, 1996, 272(5259): 263-267.

　　[14] Bartosch B, Bukh J, Meunier JC, et al. In vitro assay for neutralizing antibody to hepatitis C virus: evidence for broadly conserved neutralization epitopes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(24): 14199-14204.

　　[15] Post JJ, Pan Y, Freeman AJ, et al. Clearance of hepatitis C viremia associated with cellular immunity in the absence of seroconversion in the hepatitis C incidence and transmission in prisons    study cohort[J]. J Infect Dis, 2004, 189(10): 1846-1855.

　　[16] Cooper S, Erickson AL, Adams EJ, et al. Analysis of a successful immune response against hepatitis C virus[J]. Immunity, 1999, 10(4): 439-449.

　　[17] Choo QL, Kuo G, Ralston R, et al. Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(4): 1294-1298.

　　[18] Esumi M, Rikihisa T, Nishimura S, et al. Experimental vaccine activities of recombinant E1 and E2 glycoproteins and hypervariable region 1 peptides of hepatitis C virus in chimpanzees[J]. Arch Virol, 1999, 144(5): 973-980.

　　[19] Zibert A, Meisel H, Kraas W, et al. Early antibody response against hypervariable region 1 is associated with acute selflimiting infections of hepatitis C virus[J]. Hepatology, 1997, 25(5): 1245-1249.

　　[20] Farci P, Shimoda A, Coiana A, et al. The outcome of acute hepatitis C predicted by the evolution of the viral quasispecies[J]. Science, 2000, 288(5464): 339-344.

　　[21] Houghton M, Abrignani S. Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus[J]. Nature, 2005, 436(7053): 961-966.

　　[22] Yu MY, Bartosch B, Zhang P, et al. Neutralizing antibodies to hepatitis C virus (HCV) in immune globulins derived from antiHCVpositive plasma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(20): 7705-7710.

　　[23] Logvinoff C, Major ME, Oldach D, et al. Neutralizing antibody response during acute and chronic hepatitis C virus infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(27): 10149-10154.

　　[24] Lavillette D, Morice Y, Germanidis G, et al. Human serum facilitates hepatitis C virus infection, and neutralizing responses inversely correlate with viral replication kinetics at the acute phase of hepatitis C virus infection[J]. J Viro, 2005, 79(10): 6023-6034.

　　[25] Torresi J, Bharadwaj M, Jackson DC, et al. Neutralising antibody, CTL and dendritic cell responses to hepatitis C virus: a preventative vaccine strategy[J]. Current Drug Targets, 2004, 5(1): 41-56.

　　[26] Esumi M, Zhou YH, Tanoue T, et al. In vivo and in vitro evidence that crossreactive antibodies to Cterminus of hypervariable region 1 do not neutralize heterologous hepatitis[J]. Vaccine, 2002, 20(25-26): 3095-3103.

　　[27] Owsianka A, Tarr AW, Juttla VS, et al. Monoclonal antibody AP33 defines a broadly neutralizing epitope on the hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein[J]. J Virol, 2005, 79(17): 11095-11104.

　　[28] Tarr AW, Owsianka AM, Timms JM, et al. Characterization of the hepatitis C virus E2 epitope defined by the broadly neutralizing monoclonal antibody AP33[J]. Hepatology, 2006, 43(3): 592-601.

　　基金項(xiàng)目: 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30571673）

　　(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 北京 100052)

作者：張柯, 阮力, 譚文杰