MyD88 RNA干擾抑制小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】  目的：針對(duì)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）髓性分化因子88（MyD88），采用RNA干擾技術(shù)抑制其合成，觀察脂多糖（LPS）刺激后DC生物學(xué)活性的變化，探討獲得耐受性DC的方法，為DC的臨床應(yīng)用提供新思路和理論依據(jù)。方法：培養(yǎng)小鼠骨髓源性DC，分為對(duì)照組、LPS組及RNA干擾組，對(duì)照組不予任何處理，LPS組加入終濃度為1 μg/ml的LPS, RNA干擾組于加入MyD88 siRNA 12小時(shí)后給予1 μg/ml LPS刺激，繼續(xù)培養(yǎng)3天。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)DC MyD88、核因子κB（NFκB）的表達(dá)，Western blot檢測(cè)DC MyD88的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC細(xì)胞表面CD80、CD86及MHCⅡ分子的變化，ELISA法檢測(cè)各組DC分泌TNFα。IFNγ和IL12的濃度，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)T細(xì)胞增殖能力。結(jié)果：LPS促進(jìn)DC高表達(dá)CD80、CD86及MHCⅡ分子，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子釋放、MyD88高表達(dá)及NFκB核移位，并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，MyD88 siRNA可阻斷LPS的這些效應(yīng)。結(jié)論：MyD88 siRNA可抑制DC成熟，產(chǎn)生耐受性DC，增強(qiáng)同種未成熟DC的免疫耐受誘導(dǎo)作用，為進(jìn)一步研究DC的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】  樹(shù)突狀細(xì)胞 MyD88 RNA干擾 脂多糖

　　Inhibition effect of MyD88 siRNA to the activation of dendritic cells from murine bone marrow

　　CHEN JiaJun, SUN ZongQuan, SU Gang, LIU Chao, LIU JinPing, DENG YongZhi, SHI JiaWei.

　　Department of Cardiovascular Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

　?。跘bstract］ob[x]jective:To observe the impact of myeloid differentiaion factor 88(MyD88) siRNA on the biological activities of dendritic cells(DCs) cultured from murine bone marrow under stimulation by Lipopolysaccharides(LPS), and provide novel ideas and basis of DC’s clinical applications.Methods:Mouse DCs were generated from bone marrow cells and were divided into control group, LPS group and RNA interference group. Control group was added nothing, and LPS group was added LPS at the final concentration of 1 μg/ml. MyD88 siRNA was added in RNA interference group, and 12 hours later LPS at the final concentration of 10 μg/ml was added. All groups were cultured for 3 days thereafter. Immunochemistry was used to detect the concentration of MyD88 and NFκB. Western blot was used to detect the concentration of MyD88. Flow cytometry and mixed lymphocyte reaction(MLR) was used to detect the phenotypes and functional properties of DCs. ELISA was used to detect the concentration of TNFα, IFNγ and IL12 in the supernatant.Results:LPS stimulation increased the CD80, CD86, MHCⅡ on the membrane of DCs and TNFα, IFNγ, IL12 concentration in the supernatant. LPS stimulation also increased the MyD88 in the cytoplasm and promoted translocation of NFκB to karyon. MyD88 siRNA can inhibit all these responess.Conclusion:MyD88 siRNA can suppress maturation of DCs and promote the toleranceinduction effect of DCs.

    ［Key words］Dendritic cells；MyD88；RNA interference；Lipopolysaccharides
   
　　樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)是體內(nèi)功能強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，其功能與成熟狀態(tài)密切相關(guān)，具有激發(fā)免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受的雙重作用，參與炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病及移植排斥反應(yīng)等多種病理生理過(guò)程。利用DC具有誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受的特性，構(gòu)建耐受性DC用于治療自身免疫性疾病目前研究表明，Toll樣受體及其信號(hào)途徑在調(diào)控DC成熟過(guò)程中起重要作用，阻斷Toll 樣受體信號(hào)途徑是有效獲取耐受性DC的方法之一［2］。髓性分化因子88（MyD88）是Toll樣受體信號(hào)途徑中重要的銜接分子，其功能缺陷可導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)中斷。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制MyD88合成，觀察小鼠骨髓DC生物學(xué)活性的變化，以期獲得耐受性DC，為DC的臨床應(yīng)用提供新思路和理論依據(jù)。

　　1  材料與方法

　　1.1  試驗(yàn)材料

　　近交系BALB/c小鼠和C57雄性小鼠，6～10周齡，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所；10%FCS和RMPI1640培養(yǎng)液（Gibco公司）；重組小鼠GMCSF（rmGMCSF，PEPROTECH公司）；LPS(InvivoGen公司)；FITC標(biāo)記的抗小鼠CD80及CD86購(gòu)自BioLegend公司；FITC標(biāo)記的抗小鼠MHCⅡ類分子抗體（antimouse IAd）購(gòu)自PharMingen公司；小鼠細(xì)胞因子定量檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自晶美公司；抗小鼠NFκB/P65抗體及MyD88抗體購(gòu)自LAB VISION公司；MyD88 siRNA、RNAimate為上海吉瑪制藥公司產(chǎn)品。

　　1.2  小鼠骨髓源性DC 的分離和培養(yǎng)

　　無(wú)菌條件下取BALB/c小鼠雙側(cè)股骨、脛骨和肱骨，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗骨髓腔制備骨髓懸液，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，用RPMI1640全培養(yǎng)液配成2×106 ml-1的細(xì)胞懸液，分至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入GMCSF 20 ng/ml，每3天半量換液，并補(bǔ)充等劑量的GMCSF。8天時(shí)DC純度可達(dá)80%以上，此時(shí)收集細(xì)胞，用PBS洗滌后分為三組，①對(duì)照組：培養(yǎng)過(guò)程中不加LPS及MyD88 siRNA；②LPS組：加入終濃度為1 μg/ml的LPS；③RNA干擾組：加入MyD88 siRNA 12小時(shí)后給予1 μg/ml LPS刺激。三組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3天。

　　1.3  MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染方法

　　于500 μl的無(wú)血清培養(yǎng)基中稀釋5 μg siRNA，加入15 μg RNAimate試劑，溫育30分鐘使復(fù)合物形成；將上述體系加入含DC的6孔板中，終體積為2 ml，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3天，熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

　　1.4  MyD88、NFκB的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

　　參照文獻(xiàn)［3］的方法，檢測(cè)各組DC MyD88、NFκB的表達(dá)。

　　1.5  Western blot檢測(cè)DC MyD88的含量

　　參照《分子克隆》的實(shí)驗(yàn)方法，包括蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)印、雜交及顯色，以面積×灰度值表示MyD88的含量，計(jì)算各組與對(duì)照組的比值。

　　1.6  流式細(xì)胞儀(FACS)鑒定DC表面標(biāo)志

　　將5×105個(gè)DC懸于100 μl PBS，加入FITC標(biāo)記的各種單克隆抗體0.5 μl，4℃避光孵育30分鐘，離心棄上清，加入1 ml PBS清洗細(xì)胞1次，然后將細(xì)胞重懸于0.5 ml PBS避光置于4℃，流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測(cè)，CellQuest軟件分析。

　　1.7  DC產(chǎn)生細(xì)胞因子的檢測(cè)

　　收集培養(yǎng)3天的各組DC上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明操作，每組設(shè)3復(fù)孔，檢測(cè)細(xì)胞因子含量。

　　1.8  混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Mixed lymphocyte reaction，MLR）

　　取C57小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分層液離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，尼龍毛刷法去除粘附細(xì)胞，獲得同種異體T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞。RPMI1640培養(yǎng)液重懸培養(yǎng)獲得的DC，加入終濃度為25 ng/ml的絲裂霉素C，37℃孵育45分鐘，按照刺激細(xì)胞∶反應(yīng)細(xì)胞分別為1∶100、1∶25和1∶10的比例，將DC和T細(xì)胞置于96孔板混合培養(yǎng)，其中每孔T細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，終體積為200 μl。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，設(shè)單純T細(xì)胞組為對(duì)照組，另設(shè)空白對(duì)照孔。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3天，第3天時(shí)加入20 μl MTT，繼續(xù)避光孵育2～4小時(shí)，離心去除培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO溶解細(xì)胞，避光放置2小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)A570值，取3孔的平均值作為結(jié)果，計(jì)算刺激指數(shù)（SI）。

    SI=實(shí)驗(yàn)組A值-空白孔A值對(duì)照組A值-空白孔A值。

　　1.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。結(jié)果以x±s表示。資料分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件中OneWay ANOVA法統(tǒng)計(jì)。

　　2  結(jié)果

　　2.1  MyD88 siRNA對(duì)DC表達(dá)MyD88、NFκB的影響

　　免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)提示MyD88位于胞漿中， RNA干擾組及對(duì)照組MyD88染色示陽(yáng)性信號(hào)較弱，呈淺黃色；LPS組染色示陽(yáng)性信號(hào)增強(qiáng)，呈深棕黃色；RNA干擾組及對(duì)照組NFκB的表達(dá)主要位于胞漿，LPS組可見(jiàn)明顯NFκB移位于細(xì)胞核內(nèi)，見(jiàn)圖1～圖4。

　　2.2  Western blot檢測(cè)DC MyD88的變化

　　RNA干擾組及對(duì)照組與LPS組相比，MyD88含量明顯降低，RNA干擾組與LPS組MyD88含量比值為1∶3.2，見(jiàn)圖5。

　　2.3  MyD88 siRNA對(duì)DC細(xì)胞表面CD80、CD86及MHCⅡ分子的影響

　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，RNA干擾組、對(duì)照組CD80、CD86及MHC Ⅱ分子的表達(dá)明顯低于LPS組，見(jiàn)圖6。

　　2.4  MyD88 siRNA對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響

　　MyD88 siRNA可抑制LPS 刺激引起的Th1型細(xì)胞因子(TNFα、IFNγ、IL12)的釋放，RNA干擾組及對(duì)照組與LPS組相比差異均有顯著性（P＜0.05），各組DC上清液中細(xì)胞因子的濃度,見(jiàn)圖7。

　　2.5  混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

　　LPS組DC有明顯刺激同種異體T細(xì)胞活化增殖作用，在濃度比為1∶100時(shí)仍有明顯作用，而RNA干擾組DC則不能有效刺激同種異體T細(xì)胞活化增殖，兩組SI差異有顯著性意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。表1  各組DC對(duì)同種異體T細(xì)胞的刺激指數(shù)(略)

　　3  討論

    DC作為強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)，是聯(lián)結(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫的主要細(xì)胞，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。DC過(guò)度活化可產(chǎn)生過(guò)量炎癥因子，如TNFα、IL1和IL6等，導(dǎo)敗血癥和多器官功能衰竭［4］；DC過(guò)度活化促進(jìn)DC成熟并表達(dá)共刺激分子和細(xì)胞因子,提呈抗原給T細(xì)胞，引起急、慢性排斥反應(yīng)［5］。DC過(guò)度活化也可刺激免疫細(xì)胞成熟(如B細(xì)胞分泌抗體)，參與自身免疫性疾病及慢性炎性疾病的發(fā)生［6，7］。DC的不同表型對(duì)T細(xì)胞接受抗原刺激的反應(yīng)狀態(tài)有決定性作用，其成熟狀態(tài)對(duì)上述疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起重要作用。成熟DC表達(dá)高水平MHCⅠ、Ⅱ分子、共刺激分子和粘附分子，抗原遞呈功能很強(qiáng)，活化初始型T細(xì)胞，激活適應(yīng)性免疫；而未成熟DC盡管攝取抗原能力強(qiáng)，但不遞呈抗原，且因缺乏共刺激分子表達(dá)，不提供T細(xì)胞活化必需的第二信號(hào)，可誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能或凋亡，導(dǎo)致免疫耐受［8］。抑制DC成熟是治療上述疾病的有效方法。

    近研究表明，Toll樣受體及其信號(hào)途徑在調(diào)控DC成熟過(guò)程中起重要作用。脂多糖(LPS)、人類熱休克蛋白（HSPs）及細(xì)胞膜破損和應(yīng)激釋放的內(nèi)源性物質(zhì)等多種內(nèi)外源性配體與Toll樣受體結(jié)合觸發(fā)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)，首先TLR胞漿區(qū)段與段銜接蛋白MyD88相互作用，依次激活I(lǐng)L1受體相關(guān)激酶(NIK)和ABIAB激酶，終使IκB磷酸化而降解，激活的NFκB移位入核內(nèi)，啟動(dòng)免疫反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄激活，從而促進(jìn)DC活化。在TLRs信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，各種信號(hào)物質(zhì)的激活和失活必須依賴于MyD88這種轉(zhuǎn)載分子，其分子質(zhì)量為35 kU，具有兩個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)區(qū)域，即N端死亡域和C端TIR結(jié)構(gòu)域，C端TIR域承接TLRs活化信號(hào)，N端死亡結(jié)構(gòu)域激活胞內(nèi)下游信號(hào)，其功能缺陷可導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)中斷［9］。以MyD88為靶位阻斷TLRs信號(hào)途徑獲得耐受性DC可能為治療上述疾病提供新思路。

    RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)是近年出現(xiàn)的新的基因技術(shù)，能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶序列表達(dá)。其原理是21～25 nt小干涉RNA(Small interfering RNA, siRNA)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞直接觸發(fā)RNAi，通過(guò)核酸內(nèi)切酶、外切酶和解旋酶作用，特異性降解同源mRNA，阻止靶蛋白表達(dá)。與反義技術(shù)、核酶技術(shù)及抗體介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默技術(shù)相比，RNAi具有高效、特異等優(yōu)點(diǎn)［10］。針對(duì)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子MyD88，我們采用化學(xué)合成法合成3對(duì)MyD88siRNA，篩選其中一對(duì)高效RNA，其序列為：5′GACUGAUUCCUAUUAAAUA3′和5′UAUUUAAUAGGAAUCAGUC3′。

    本實(shí)驗(yàn)研究了脂多糖刺激對(duì)DC成熟狀態(tài)的影響。實(shí)驗(yàn)顯示，未轉(zhuǎn)染siRNA的DC經(jīng)LPS刺激后其表面共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ分子均上調(diào)，分泌Th1型細(xì)胞因子TNFα、IFNγ及IL12明顯增多，免疫組化顯示DC內(nèi)MyD88表達(dá)增強(qiáng)，NFκB 也從胞漿移位至核內(nèi)（NFκB的活化是DC成熟的標(biāo)志之一），混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)示T細(xì)胞增殖能力提高，提示LPS可通過(guò)激活TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)DC成熟，激活特異性免疫反應(yīng)，與以往研究結(jié)果一致［11］。

    本實(shí)驗(yàn)還研究了MyD88 siRNA對(duì)DC表達(dá)MyD88及其成熟狀態(tài)的影響。MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染DC后，免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blot檢測(cè)示該序列可顯著抑制MyD88的合成，LPS刺激后DC共刺激分子CD80、CD86、MHCⅡ分子及Th1型細(xì)胞因子均無(wú)明顯上調(diào)，NFκB核移位被抑制，刺激T細(xì)胞增殖能力下降，說(shuō)明MyD88 RNA干擾可抑制MyD88的合成進(jìn)而阻斷DC內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制DC成熟，增強(qiáng)DC的免疫耐受誘導(dǎo)作用。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MyD88是TLRs信號(hào)途徑中起重要作用的關(guān)鍵分子，MyD88 RNA干擾可阻斷TLRs信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制DC成熟，產(chǎn)生耐受性DC，從而為臨床應(yīng)用耐受性DC治療敗血癥、移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病及慢性炎性疾病提供新思路。盡管TLRs及其信號(hào)途徑在疾病發(fā)生中的作用尚未完全闡明，以它們作為靶位進(jìn)行疾病干預(yù)也還不成熟，但是可以推測(cè)，采用MyD88 RNA干擾技術(shù)阻斷TLRs信號(hào)通路將是上述疾病很有前途的治療措施。

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作者：陳家軍 孫宗全 蘇剛 劉超 劉金平 鄧勇志 史嘉瑋

作者單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心外科，武漢 430022