關(guān)鍵詞】 肝腫瘤
Effect of Danshen injection on VEGF ex[x]pression in SD rats with malignant obstructive jaundice caused by hepatocellular carcinoma
【Abstract】 AIM: To establish malignant biliary obstruction model of SD rats and to study the effects of Danshen injection on the tumor size, inhibition rates and me[x]tastasis rates of hepatocellular carcinoma and the ex[x]pression of vascular endothelia cell growth factor (VEGF) in carcinoma and pericarcinoma tissues, adjacent lobe (leftinternal lobe) as well as lung tissues. METHODS: Malignant biliary obstruction models of SD rats were made by vaccination of transplanted tumor in liver near the porta hepatis with walker256 hepatocarcinoma cell line, which infiltrated and me[x]tastasized to proximal common bile duct and caused its narrowness and obstruction. The SD rats were divided into 4 groups: 0.9% NS (n=24), Inosine+VC (n=40), Danshen (n=40) and 5FU (n=40) respectively. The diameter of transplanted tumor, inhibition rates and me[x]tastasis rates of hepatocellular carcinoma and the ex[x]pression of VEGF in carcinoma and pericarcinoma tissues, adjacent lobe (leftinternal lobe) as well as lung tissues were observed. Statistical analysis was made. RESULTS: The diameter of the tumor was reduced and the inhibition rates and me[x]tastasis rates of hepatocellular carcinoma were upgraded after treatment of Danshen injection compared with those in the rats treated by 0.9% NS. and Inosine combined with VC (P＜0.01), but the diameter of tumor was slightly downgraded after treatment of Danshen injection compared with that in the rats treated by 5FU (P＜0.01). The inhibition rates（41.7%） and the liver me[x]tastasis rate (59.7% and 81.1%) of hepatocellular carcinoma in rats treated by Danshen injection were similar with those in the rats treated by 5FU (P＜0.01). The ex[x]pressions of VEGF in carcinoma and pericarcinoma tissues were significantly downgraded after treatment of Danshen injection compared with those in the rats treated by 0.9% NS and Inosine combined with VC (P＜0.01) and with those in the rats treated by 5FU (P＜0.05). CONCLUSION: Danshen can inhibit the growth of hepatocarcinoma in SD rat models of malignant biliary obstruction through reducing the proliferation of hepatocarcinoma cells, increasing the reversion of hepatocarcinoma cells and downregulating the ex[x]pression of VEGF in carcinoma and pericarcinoma tissues.
【Keywords】 jaundice, obstructive; disease models, animal; liver neoplasms; Walker256 hepatocarcinoma cell line; vascular endothelial growth factor; Danshen
【摘要】 目的： 建立惡性梗阻性黃疸模型，通過(guò)對(duì)模型鼠ip丹參注射液，觀察其對(duì)肝癌瘤體大小、抑癌率及抑轉(zhuǎn)移率和肝癌、癌周、臨近肝葉及肺組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，評(píng)價(jià)其作用. 方法： 用Walker256肝癌株近肝門(mén)部肝實(shí)質(zhì)內(nèi)種植致移植性肝癌侵襲高位膽管，造成膽道癌性狹窄，以建立SD大鼠惡性梗阻性黃疸模型. 將模型鼠分成4組，通過(guò)對(duì)模型鼠腹腔內(nèi)分別注射等量的生理鹽水(n=24)、肌苷+VC(n=40)、丹參(n=40)和5FU(n=40). 觀察肝癌瘤體大小、抑癌率及抑轉(zhuǎn)移率和肝癌、癌周、臨近肝葉及肺組織中VEGF的表達(dá). 結(jié)果： 丹參組與生理鹽水組和肌苷+VC組相比，肝癌平均瘤體減小(0.5±0.2) cm3、抑癌率（41.7%）及抑轉(zhuǎn)移率(59.7%，81.1%)增高（P＜0.01）；與5FU組相比，平均瘤體卻較大（P＜0.01）. 在抑癌率及抑肝轉(zhuǎn)移率方面，丹參組除抑肺轉(zhuǎn)移率外與5FU組相比無(wú)差異. 丹參組VEGF在肝癌組織和癌周組織中的表達(dá)率分別低于生理鹽水組（P＜0.01）、肌苷+VC組（P＜0.01）和5FU組（P＜0.05）. 結(jié)論： 丹參在肝癌致梗阻性黃疸時(shí)，通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞分化成熟、抑制肝癌細(xì)胞增殖、降低肝癌組織和癌周組織中VEGF表達(dá)，而對(duì)腫瘤發(fā)展起抑制作用.
【關(guān)鍵詞】 黃疸，阻塞性；疾病模型，動(dòng)物；肝腫瘤；Walker256肝癌株；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類(lèi)；丹參
0引言
本實(shí)驗(yàn)用Walker256肝癌株近肝門(mén)部肝實(shí)質(zhì)內(nèi)種植致移植性肝癌侵襲高位膽管，造成膽道癌性狹窄，建立SD大鼠惡性梗阻性黃疸模型. 通過(guò)對(duì)模型ip不同的藥物，肝癌、癌周、臨近肝葉及肺組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelia cell grouth factor, VEGF）的表達(dá)，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.
1材料和方法
1.1材料
雄性SD大鼠144只，體質(zhì)量（225±25） g，另備雄性SD幼鼠10只，體質(zhì)量（100±25） g，以供癌株傳代用. 以上實(shí)驗(yàn)用鼠為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（均為近交系繁殖和封閉群體飼養(yǎng)）. Walker256肝癌細(xì)胞株用人乳腺癌肉瘤誘導(dǎo)傳代培育而成的鼠肝癌株，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所提供，已穩(wěn)定傳代50次以上. 抗VEGF鼠單克隆抗體（Labvision com)、 Supervision免疫組化
試劑盒（單抗鼠IgG）、Envision免疫組化染色劑盒（單抗鼠IgG）、DAB顯色劑均由DAKO公司提供；復(fù)方丹參注射液（上海第九制藥廠,批號(hào)00124509）.
1.2方法
惡性梗阻性黃疸模型的建立［1］: 將Walker256瘤株從液氮中復(fù)蘇，在傳代鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行瘤株擴(kuò)增后,注入傳代SD幼鼠下肢內(nèi)側(cè)皮下. 5 d后，在無(wú)菌條件下摘出實(shí)體瘤，取邊緣生長(zhǎng)活躍的魚(yú)肉樣癌組織,切成1 mm×1 mm×1 mm瘤塊，置于冰生理鹽水中漂洗后備接種用. 將SD大鼠用20 g/L戊巴比妥（1.3 mL/kg）ip麻醉后，常規(guī)消毒，行腹正中切口進(jìn)腹，充分顯露肝門(mén)，置手術(shù)
放大鏡視野下，在肝右葉與肝中葉的交界部距肝門(mén)5 mm處，用眼科鑷逆膽管走行方向潛行造隧深約3 mm，植入備用的瘤塊后，用
棉簽壓迫止血. 依次關(guān)腹，結(jié)束手術(shù). 常規(guī)飼養(yǎng)7 d，即可完成模型鼠的復(fù)制［1］. 將不合格的模型鼠剔除（接種失敗、腹腔接種及無(wú)黃疸者）后，隨機(jī)分成4組： A組（生理鹽水治療組）24只，ip NS，劑量為10 mL/kg×7 d. B組（肌苷+VC治療組）40只，ip肌苷、VC各5mL/kg ×7d. C組（丹參治療組）40只，ip丹參10 mL/kg×7 d. D組（5FU組）40只，ip 300 mg/kg×7 d. 結(jié)果實(shí)際得到觀察數(shù)為A組16只、B組26只、C組34只及D組30只. 將4組實(shí)驗(yàn)鼠分別ip不同藥物7 d后，用乙醚開(kāi)放吸入麻醉后，行正中十字切口入腹，沿
胸骨正中打開(kāi)胸腔，迅速剪開(kāi)心包行左心室
插管，先快后慢灌注生理鹽水100 mL和40 g/L多聚甲醛（0.1mol/L）PB固定液300 mL，剪開(kāi)右心耳放血. 待全身灌注固定完全后，切取肝臟及腫瘤、肺臟標(biāo)本. 將組織塊放入40 g/L多聚甲醛溶液中，選材、脫水及石蠟包埋. 記錄腫瘤體積、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及肺轉(zhuǎn)移情況，并計(jì)算： 腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2÷2，抑瘤率=［（對(duì)照組平均瘤體-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體）÷對(duì)照組平均瘤體］×，抑轉(zhuǎn)移率=［（對(duì)照組平均轉(zhuǎn)移率―實(shí)驗(yàn)組平均轉(zhuǎn)移率）÷對(duì)照組平均轉(zhuǎn)移率］×. 將選取肝瘤組織、瘤周組織、鄰近肝近肝葉（左內(nèi)葉）及肺組織行HE染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；同時(shí)選取肝癌、癌周中VEGF表達(dá)的免疫組化檢查.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 計(jì)量資料以x±s表示，使用 SSPS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)多組計(jì)量資料進(jìn)行KruskalWallis H檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行R×C 表χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
2結(jié)果
2.1形態(tài)學(xué)觀察A組肝癌生長(zhǎng)良好，異型性高，瘤體大于1 cm3時(shí)可見(jiàn)瘤體中心部干酪樣壞死；癌周血管豐富，管徑大小不一，分布密集(Fig 1). B組肝癌生長(zhǎng)良好，異型性高，瘤體體積大于1 cm3時(shí)可見(jiàn)瘤體中心部干酪樣壞死；癌周血管豐富，管徑大小不一，分布密集. C組肝癌生長(zhǎng)不良，異型性低，成熟分化比率高，肝癌組織中癌細(xì)胞呈片狀病變區(qū)，周邊部以細(xì)胞凋亡為主，而中心部以細(xì)胞壞死為主. 瘤體體積小于1 cm3時(shí)就可見(jiàn)瘤體中心部干酪樣壞死；癌周血管稀少，管徑大小均勻，散在分布. D組肝癌生長(zhǎng)不良，但異型性高. 瘤體體積大于1 cm3時(shí)才可見(jiàn)瘤體中心部干酪樣壞死；癌周血管稀少，管徑大小不一，分布集中.
2.2肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響丹參組抑瘤率明顯高于肌苷+VC保肝對(duì)照組(P＜0.01)；而與5FU抗癌對(duì)照組抑瘤率相比，雖數(shù)值上較低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 丹參組抑制肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率和抑制肺部轉(zhuǎn)移率明顯高于肌苷+VC保肝對(duì)照組(P＜0.01）；與5FU抗癌對(duì)照組相比，在抑制肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率方面數(shù)值相近；而在抑制肺部轉(zhuǎn)移率方面，數(shù)值上高于5FU組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 1).表1各組模型鼠腹腔內(nèi)不同藥物注射對(duì)肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響（略）
2.3肝癌、癌周、臨近肝葉（肝左內(nèi)葉）組織VEGF的表達(dá)丹參治療組肝癌、癌周VEGF(Fig 2)的表達(dá)例數(shù)均明顯低于生理鹽水組(Fig 3)和肌苷+VC組(P＜0.01）. 而在臨近肝葉（肝左內(nèi)葉）及肺組織中丹參組VEGF的表達(dá)例數(shù)與生理鹽水組和肌苷+VC組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 與5FU抗癌對(duì)照組相比，雖數(shù)值上表達(dá)較低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 2).表2肝癌、癌周、臨近肝葉及肺組織中VEGF的表達(dá)（略）
3討論
惡性梗阻性黃疸是普外科常見(jiàn)癥候群，其發(fā)病肝臟局部而危及全身臟器，引起不可逆的病理生理改變，故在圍手術(shù)期處理方面歷來(lái)受到醫(yī)學(xué)界的高度重 視. VEGF是主要的促血管生長(zhǎng)因子，是腫瘤血管形成的關(guān)鍵因素［2］，是肝癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ). 以往對(duì)丹參的非瘤疾病的藥理作用研究較［3］，如抗血板聚集、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)血液流變學(xué)、增強(qiáng)機(jī)體免疫、逆轉(zhuǎn)慢性肝病纖維化作用、調(diào)節(jié)血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用及對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷保護(hù)作用，并在臨床得到廣泛應(yīng)用，取得較滿(mǎn)意的療效. 但丹參對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒殺傷作用、誘導(dǎo)腫瘤成熟分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等機(jī)制研究甚少. 近年來(lái)隨著抗癌中藥研究的日益深入，丹參抗腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究得以重視. 本實(shí)驗(yàn)觀察顯示，丹參組肝癌平均瘤體減小、抑癌率及抑轉(zhuǎn)移率增高，丹參組VEGF表達(dá)在肝癌組織與正常肝細(xì)胞交界處表達(dá)豐富，肝癌組織中心部VEGF表達(dá)反而減少；形態(tài)學(xué)腫瘤血管管徑較粗、大小均一. 癌組織中瘤體體積小于1 cm3可見(jiàn)干酪樣壞死，提示丹參在肝癌致梗阻性黃疸時(shí)，通過(guò)促進(jìn)丹參誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞成熟分化［4］，降低肝癌、癌周組織中VEGF表達(dá)，阻止肝腫瘤血管形成等機(jī)制而對(duì)腫瘤發(fā)展起抑制作用.
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