糖化終末產(chǎn)物受體在大鼠胰腺星形細(xì)胞中的表達(dá)

作者：李曉永，張洪梅，董艷，葛勤敏，陳寒蓓，劉繼紅,代伶俐,周亞琴,蘇青

作者單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200092

【摘要】  　　目的 研究胰腺星形細(xì)胞（PSCs）是否表達(dá)糖化終末產(chǎn)物受體（RAGE），并探討糖化終末產(chǎn)物（AGEs）對(duì)RAGE表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法 分離培養(yǎng)SD大鼠PSCs,采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)靜息和活化的PSCs RAGE在mRNA和蛋白水平的表達(dá),同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)AGEs刺激后RAGE表達(dá)的變化。結(jié)果 靜息和活化的PSCs均表達(dá)RAGE，且活化后表達(dá)水平提高；AGEs能上調(diào)RAGE的表達(dá)。結(jié)論 靜息和活化的PSCs均表達(dá)RAGE，活化的PSCs RAGE表達(dá)上調(diào)，提示PSCs是AGEs作用的靶細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】  胰腺星形細(xì)胞；糖化終末產(chǎn)物受體；纖維化

　　ex[x]pression of receptor for advanced glycation end products in pancreatic stellate cells of rats

　　LI Xiao-yong,ZHANG Hong-mei,DONG Yan,et al

　?。―epartment of Endocrinology，the Affiliated Hospital of Xinhua,Medicine College of Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092,China）
   
　　Abstract:  ob[x]jective  To investigate the ex[x]pression of the receptor for advanced glycation end-produts(RAGE) in pancreatic stellate cells（PSCs）and to explore the role of advanced glycation end-produts(AGEs) in its ex[x]pression.Methods  Rat PSCs were isolated from normal rat pancreas.ex[x]pression of RAGE was detected at mRNA and protein levels by semi-quantitative reverse transc[x]ription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunocytochemistry.Then RAGE mRNA level was analyzed by RT-PCR after AGEs stimulation．Results  Both the quiescent and activated PSCs expressed RAGE,and RAGE ex[x]pression was much higher in activated cells than that in quiescent cells.In addition,cultured PSCs could increase ex[x]pression of RAGE mRNA when exposed to AGEs.Conclusion  Both the quiescent and activated PSCs express RAGE and PSCs RAGE can upregulate its ex[x]pression,it indicates that PSCs is an important target of AGEs.
   
　　Key words:  pancreatic stellate cells;receptor for advanced glycation end-produts；fibrosis
  
　　大量研究表明糖尿病動(dòng)物模型和糖尿病患者的內(nèi)外分泌胰腺都存在著廣泛的纖維化和功能異常［1-6］。由于胰腺星形細(xì)胞（pancreatic stellate cells,PSCs）的增殖和激活是胰腺細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）形成的主要原因［7］，而且在2型糖尿?。═2DM）動(dòng)物模型，隨著糖尿病的進(jìn)展，常伴隨胰腺纖維化區(qū)PSCs的激活［1，3，5］，因此糖尿病時(shí)胰腺纖維化也可能和PSCs激活有關(guān)。有研究表明糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation end produts,AGEs）通過其特異性受體（receptor for AGEs,RAGE）誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation)和ECM的合成,從而促進(jìn)這些部位纖維化的發(fā)生和發(fā)展［8-9］。對(duì)于PSCs是否也是AGEs的靶目標(biāo)國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)將研究PSCs是否表達(dá)RAGE受體，同時(shí)探討AGEs對(duì)其自身受體表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

　　1  材料與方法

　　1.1  動(dòng)物  雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003,飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠飼養(yǎng)2個(gè)月后，體質(zhì)量300～400 g時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。分離細(xì)胞前12 h禁食，自由飲水。

　　1.2  主要儀器及試劑  DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；D-葡萄糖購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；膠原酶IV、DNase I，鏈霉蛋白酶E和Nycodenz購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠RAGE受體多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗和DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司；二步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；HF90/HF240型CO2培養(yǎng)箱(上海力康發(fā)展有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠紫外成像儀(英國(guó)Syngene公司)；F- 4500熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

　　1.3  AGEs-BSA的制備和鑒定  參考文獻(xiàn)［10-11］制備和純化AGEs:準(zhǔn)確稱取0.5 g BSA溶解于10 mL pH 7.4、0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)中，然后加入0.9 g D-葡萄糖，待其溶解后，0.22 μm針頭濾器抽濾除菌,37 ℃避光孵育120 d取出,將之置于透析袋中透析24 h,每3 h換透析液充分除去未結(jié)合的葡萄糖，后得到棕黃色的AGEs-BSA。用相同的方法去除D-葡萄糖制備非糖化BSA作為對(duì)照。制備的AGEs-BSA用AGEs熒光光譜掃描后發(fā)現(xiàn)其激發(fā)高峰位于360 nm,發(fā)射高峰位于446 nm，證實(shí)BSA已轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的AGEs。

　　1.4  PSCs的分離、培養(yǎng)及處理  按參考文獻(xiàn)［12］方法分離PSCs，并略作改進(jìn)。步驟簡(jiǎn)述如下：選體質(zhì)量300～400 g的SD大鼠戊巴比妥鈉(30 g·L-1)麻醉后，無菌條件下剖腹，結(jié)扎膽總管近端，采用順行膽管插管法將適量37 ℃預(yù)溫的酶消化液（含12.5 U膠原酶IV、21 U鏈酶蛋白酶、5 000 U DNaseI，用D-Hanks配）注入膽總管內(nèi)后，迅速分離胰腺并去掉周圍脂肪組織，將胰腺剪碎置于上述酶消化液中37 ℃充分消化，待胰腺呈現(xiàn)泥沙狀時(shí)終止并用200目鋼網(wǎng)過濾，濾液用120 g·L-1Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心分離PSCs。熒光顯微鏡鑒定細(xì)胞純度為85%～90%，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力為96%。初分離的PSCs培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)20%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞種植后24 h換液，此后2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合后用含乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)的胰酶消化傳代培養(yǎng)。選用第2代細(xì)胞為研究對(duì)象，研究AGEs對(duì)其受體表達(dá)的影響。具體處理如下：當(dāng)?shù)?代細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)，用含體積分?jǐn)?shù)0.1%FBS的DMEM培養(yǎng)24 h使細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，棄培養(yǎng)基后各孔加入含0 mg·L-1及50 mg·L-1 AGEs的培養(yǎng)基和含50 mg·L-1 BSA的培養(yǎng)基(對(duì)照組)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，收集刺激24 h后的細(xì)胞。

　　1.5  免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PSCs RAGE受體的表達(dá)  將初分離的PSCs種植于含有蓋玻片的六孔板內(nèi)，取培養(yǎng)3 d（靜息細(xì)胞）和培養(yǎng)14 d（活化細(xì)胞）的細(xì)胞爬片用PBS清洗2遍,以去除培養(yǎng)液及胎牛血清，室溫下用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，30 g·L-1BSA封閉10 min，滴加兔抗大鼠RAGE多抗(1300)，濕盒內(nèi)4 ℃過夜；PBS清洗2遍，濾紙吸干后滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫放置1 h；PBS清洗2遍后DAB顯色；用蘇木素襯染細(xì)胞核，逐級(jí)脫水后，中性樹膠封片。PBS 代替一抗做陰性對(duì)照，棕黃色染色為陽性。

　　1.6  逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法檢測(cè)PSCs RAGE mRNA的表達(dá)  分別收集原代培養(yǎng)3 d（靜息細(xì)胞）、培養(yǎng)14 d（活化細(xì)胞）及AGEs刺激24 h后的細(xì)胞，用TRIzol試劑一步法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度法定量后，按照美國(guó)Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以O(shè)ligo(dT)為引物合成cDNA。用Premier5.0設(shè)計(jì)RAGE及管家基因GAPDH引物。RAGE正向引物：5′-CAGGGTCACAGAAACCGG-3′；反向引物:5′-ATTCAGCTCTGCACG TTCCT-3′，產(chǎn)物214 bp，退火溫度60 ℃；GAPDH正向引物：5′-AAGAAGGTGG TGAAGCAGGC-3′;反向引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，產(chǎn)物300 bp，退火溫度56 ℃。各樣品目的基因和管家基因分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，產(chǎn)物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳后，Smart View凝膠分析程序分析目的基因和內(nèi)參照GAPDH之間的灰度比值，此即為樣品基因校正后的相對(duì)表達(dá)量。

　　1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  采用SPSS 10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。P<0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

　　2  結(jié)果

　　2.1  RAGE受體在靜息和活化的PSCs上的表達(dá)  經(jīng)細(xì)胞免疫染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3 d和14 d的PSCs都表達(dá)RAGE受體，陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色（圖1A，圖1B）,陰性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)未見棕黃色陽性顆粒(圖1C,圖1D)，而且發(fā)現(xiàn)活化的PSCs棕色顆粒較培養(yǎng)3 d的PSCs著色為深。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)也發(fā)現(xiàn)活化的PSCs在mRNA水平較靜息的PSCs增加(2.1±0.13)倍（P<0.05），見圖2。

　　圖1  RAGE在PSCs中表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)  (SP染色  ×200)（略）

　　A、C：原代培養(yǎng)3 d的靜息PSCs  B、D：原代培養(yǎng)14 d的激活PSCs

　　Fig.1  ex[x]pression of RAGE protein in PSCS by immmunocytochemical staining  (SP staining  ×200)

　　A,C:3 d primary culture quiescent PSCs;B,D:14 d primary culture activated PSCs

　　2.2  AGEs對(duì)活化的PSCs RAGE mRNA表達(dá)水平的影響  傳代培養(yǎng)的大鼠PSCs在AGEs刺激24 h后RAGE mRNA表達(dá)水平較同濃度BSA刺激組高(1.58±0.03)倍（P<0.05），比無刺激的對(duì)照組高(1.50±0.02)倍（P<0.05）,而BSA組和對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見圖3。

　　圖2  原代培養(yǎng)3 d（靜息）與原代培養(yǎng)14 d（激活）的PSCs RAGE mRNA 條帶灰度的相對(duì)值  (aP<0.01)（略）

　　Fig.2  Relative value of absorption of RAGE mRNA band in 3d primary culture quiescent PSCs and 14 d primary culture activated PSCs  (aP<0.01)

　　圖3  正常對(duì)照組、50 mg·L-1 BSA 及50 mg·L-1 AGEs處理后PSCs RAGE mRNA 條帶灰度的相度值（略）

　　1:0 mg·L-1 AGEs;2:50 mg·L-1 BSA;3:50 mg·L-1 AGEs

　　Fig.3  Relative value of absorption of RAGE mRNA band in normal control group、50 mg·L-1 BSA group and experimental PSCs group treated by 50 mg·L-1 AGEs

　　1:0 mg·L-1 AGEs;2:50 mg·L-1 BSA;3:50 mg·L-1 AGEs

　　3  討論
   
　　PSCs是位于胰腺小葉間和腺泡周圍的間質(zhì)細(xì)胞，胰島內(nèi)不存在。正常情況下其呈靜息狀態(tài)，僅合成少量的Ⅲ型膠原等ECM成分,因此其功能可能與維持胰腺的正常組織結(jié)構(gòu)有關(guān)。當(dāng)PSCs離體培養(yǎng)或胰腺發(fā)生損傷時(shí)，其可被激活，激活后的PSCs轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（myofibroblast-like cells），該表型可具有高度自我增殖能力，并能合成和分泌大量Ⅰ型、Ⅲ型膠原等多種ECM成分［13］。有研究表明，PSCs可能是胰腺ECM蛋白的主要來源,在慢性胰腺炎纖維化形成中起著關(guān)鍵作用［7］。Kawano等［14］發(fā)現(xiàn)在T2DM模型OLETF(otsuka long-evans tokushima fatty)大鼠，隨著鼠齡的增加胰島出現(xiàn)進(jìn)行性纖維化：20周齡以后的胰島纖維化和增大非常明顯，胰島被結(jié)締組織分割成小簇狀，40周齡以后部分胰島便被結(jié)締組織取代。Yoshikawa等［1］除觀察到與之相似的胰島纖維化改變外，尚發(fā)現(xiàn)結(jié)締組織增生從胰島周圍的間質(zhì)向鄰近的外分泌腺延伸，后觀察到胰腺的廣泛萎縮和結(jié)締組織增生。Zhao等［4］以235個(gè)中國(guó)T2DM患者為研究對(duì)象通過病理活檢發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病的發(fā)展，57.9%的患者出現(xiàn)胰腺的彌漫性纖維化，其中有7.7%的患者胰腺間質(zhì)出現(xiàn)增寬的結(jié)締組織。在OLETF大鼠，隨著疾病的進(jìn)展，常伴隨有胰腺纖維化區(qū)PSCs的激活，特別在纖維化胰島結(jié)構(gòu)周圍［1,3,5］。由于活化的PSCs具有一定的移行能力［15］，因此纖維化區(qū)域的PSCs除來源于PSCs的增殖外還可能來自周圍活化PSCs的移行。
   
　　目前，糖尿病時(shí)PSCs激活的具體機(jī)制還不清楚。AGEs是還原糖(主要是葡萄糖)與蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)形成的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。AGEs形成增多是糖尿病的重要特征，與糖尿病并發(fā)癥之間有密切的聯(lián)系［16］。AGEs能直接通過修飾ECM，抑制其降解，促進(jìn)機(jī)體纖維化的發(fā)生。此外，近有研究發(fā)現(xiàn)在尿毒癥患者AGEs能通過腹膜間皮細(xì)胞的RAGE促進(jìn)其轉(zhuǎn)分化和腹膜纖維化的發(fā)生［9］；在腎小球系膜細(xì)胞,AGEs也能通過RAGE誘導(dǎo)其增生肥大和纖連蛋白的合成,從而促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展［8］，因此，AGEs-RAGE受體途徑在纖維化過程中也起著重要的作用。而PSCs和腎小球系膜細(xì)胞有許多相似的地方，即激活后都轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞表型［17］，這些研究提示PSCs可能也是AGEs的靶細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心方法分離培養(yǎng)SD大鼠PSCs,以原代培養(yǎng)3 d和培養(yǎng)14 d的PSCs分別代表靜息和體外活化的PSCs，作者首先用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)到RAGE受體在靜息和活化的PSCs均有表達(dá)，且活化后的細(xì)胞RAGE染色更深，這在半定量高敏感逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)中也得到了進(jìn)一步的證實(shí)，提示AGEs也可能直接通過RAGE受體對(duì)PSCs起作用，RAGE的表達(dá)上調(diào)可能和細(xì)胞的活化相關(guān)。
   
　　AGEs-RAGE相互作用可通過氧化應(yīng)激引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而在糖尿病血管病變中起著重要作用［18］。而AGEs的聚集可上調(diào)其RAGE受體，該正反饋機(jī)制可加速糖尿病微血管和大血管病變的發(fā)生［19］。為研究AGEs是否對(duì)PSCs有相同的效應(yīng)，作者用50 mg·L-1的AGEs刺激PSCs 24 h后RAGE受體mRNA水平的表達(dá)較同濃度BSA組明顯升高，而BSA組和對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可見，AGEs能促進(jìn)PSCs RAGE受體的表達(dá)，從而對(duì)PSCs的影響起到正反饋的作用,這種正反饋機(jī)制可能在糖尿病時(shí)PSCs的持續(xù)激活中起著重要的作用。
   
　　該研究證實(shí)靜息和活化的PSCs均表達(dá)RAGE受體，提示PSCs是AGEs作用的靶細(xì)胞，而RAGE受體在PSCs上表達(dá)的病理生理意義還需進(jìn)一步研究。

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　　(本文編輯：楊 博 英文編輯：楊 博）