改良鹽酸胍法提取臍血DNA用于HLA基因分型

　作者：湯雪薇,廖燦,李焱,謝杏梅,黃以寧　　作者單位：廣州市婦嬰醫(yī)院廣州臍血庫，廣州 510180

　　【摘要】為了比較經(jīng)典的鹽酸胍(Gu•HCl)抽提DNA法和改良鹽酸胍抽提DNA法在提取臍血DNA的效果，探討這兩種方法在臍血組織相溶性抗原(HLA)基因分型中的應(yīng)用，使用鹽酸胍抽提DNA法和改良鹽酸胍抽提DNA法提取72例臍血標(biāo)本的DNA，并分別測(cè)定其DNA的濃度和純度，采用序列特異性引物聚合酶反應(yīng)方法(PCR-SSP)比較這兩種方法所提取的DNA?！〗Y(jié)果表明：兩種方法提取臍血DNA均獲成功;根據(jù)對(duì)DNA的質(zhì)量監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，用改良鹽酸胍抽提DNA在質(zhì)量上較鹽酸胍法好; 用于HLA基因分型時(shí)，改良鹽酸胍抽提DNA法可減少非特異性條帶的出現(xiàn)?！〗Y(jié)論：改良鹽酸胍抽提DNA法不但操作簡便，成本下降，而且在少血量中能提取出高純度的DNA，減少非特異性條帶的出現(xiàn)。該法完全可以滿足臍血庫的日常臍血樣品DNA的提取以及臍血HLA基因分型的要求。

　　【關(guān)鍵詞】 DNA提取

　　Abstract To compare two different methods for extracting genomic DNA from cord blood and to evaluate their applications for HLA genotyping，the genomic DNA from 72 samples was extracted by guanidine hydrochloride (Gu•HCl) and modified guanidine hydrochloride，the DNA yield and purity were evaluated by spectrophotometry and detected by PCR with sequence-specific primers. The result showed that the genomic DNA was successfully isolated from whole blood by both methods.The modified Gu•HCl method used was better than Gu•HCl method as the modified method produces better quality of DNA and less ambiguous bands in PCR. It is concluded that modified Gu•HCl method has the advantages of low-cost，simple operation，high quality output and clear positive bands in HLA-genotyping，the modified method is optimal for extracting DNA from multiple samples of cord blood bank.

　　Key words DNA extraction; guanidine hydrochloride method; modified guanidine hydrochloride method; HLA genotype

　　高產(chǎn)量和高純度的真核細(xì)胞DNA分離技術(shù)是進(jìn)行PCR，Southern blot等分子生物學(xué)研究的前提條件，而在HLA基因分型中，模板DNA的質(zhì)量是分型結(jié)果準(zhǔn)確性的重要保證。Bowtell等[1]報(bào)道的鹽酸胍法是一種較酚-氯仿法簡易的可進(jìn)行大量樣本DNA提取的較好方法，我們對(duì)相關(guān)方法做了改進(jìn)，結(jié)果表明適于臍血庫HLA基因分型。

　　材料和方法

　　材料

　　標(biāo)本

　　來自廣州臍血庫中的72份臍血標(biāo)本，為CPD-A抗凝血，-20℃保存。

　　主要試劑

　　蛋白酶K(德國 Merck產(chǎn)品)，鹽酸胍(美國Sigma產(chǎn)品)，Micro SSPTM試劑盒(美國萊姆德公司產(chǎn)品)。

　　主要儀器

　　高速冷凍離心機(jī)(Hermle ZK380)、紫外分光光度儀(Pharmacia Gene Quat II)、PE-9600 PCR儀(Perkin Elmer)，自動(dòng)凝膠成像儀(Phamacia)。

　　DNA提取

　　鹽酸胍法[1]

　　取200 μl臍血標(biāo)本用生理鹽水洗3-4 次，離心至上層液體清晰，棄去上清液后，加入 6 mol/L鹽酸胍200 μl和0.1 mol/L醋酸鈉200 μl(pH 5.5)，充分混勻，至少1小時(shí)。取以上液體至5 ml冰冷無水乙醇中，小心吸放，使絮狀物纏繞成團(tuán)。將絮狀DNA吸至新的1.5 ml離心管中，離心，加70%乙醇洗1 次，離心。室溫干燥后加無菌水溶解。-20℃保存。

　　改良鹽酸胍法

　　取600 μl臍血標(biāo)本用生理鹽水洗3-4次，離心至上層液體清晰，棄去上清液后加入6 mol/L鹽酸胍300 μl和0.1 mol/L醋酸鈉300 μl(pH 5.5)，充分混勻，至少1小時(shí)。在原1.5 ml離心管立即加入氯仿，顛倒混勻，離心，取上清液平分到2個(gè)新的1.5 ml離心管中，分別加入等量的異丙醇，顛倒混勻至有絮狀DNA沉淀出現(xiàn)，離心，棄上清。用70%乙醇洗1 次，離心。室溫干燥后，一管加無菌水溶解，另一管為干粉狀。-20℃保存。

　　DNA質(zhì)量測(cè)定

　　72份經(jīng)-20℃保存的CPD-A抗凝臍血標(biāo)本分別采用以上2種方法進(jìn)行DNA抽提，所得的DNA經(jīng)Pharmacia Gene QuatⅡ紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度(A280/A260)。

　　HLA基因配型

　　采用PCR-SSP方法。隨機(jī)挑選不同方法的不同臍血按操作方法按美國萊姆德公司的Micro SSPTM試劑盒(HLA-DRB)說明書進(jìn)行HLA基因配型。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖電泳后，EB染色，自動(dòng)成像儀照相。利用人工和電腦軟件同時(shí)判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　結(jié)果

　　DNA的提取結(jié)果和純度測(cè)定

　　受測(cè)試的72份臍血標(biāo)本，用鹽酸胍法和改良的鹽酸胍法提取DNA，兩種方法均全部成功，但后者優(yōu)于前者。

　　HLA基因分型

　　鹽酸胍法和改良鹽酸胍法提取的DNA基因分型結(jié)果，除內(nèi)參條帶和陽性條帶外，在電泳孔附近出現(xiàn)非特異性條帶及拖尾現(xiàn)象，以及在后一孔出現(xiàn)弱的假陽性條帶，這是由于DNA的純度不足所致，在判斷結(jié)果時(shí)會(huì)產(chǎn)生不良影響，由于DNA的質(zhì)量改進(jìn)，以上的現(xiàn)象大有改善，這樣增加了基因分型的準(zhǔn)確性。

　　討 論

　　HLA基因分型隨著在臨床移植中應(yīng)用的開展，發(fā)展迅速，相繼建立了各種的DNA分型方法。這些方法可以檢測(cè)出僅相差幾個(gè)堿基的HLA等位基因，如PCR-SSOP方法能探測(cè)出1-2個(gè)堿基的差異[2]。在引物的選擇與設(shè)計(jì)，酶的質(zhì)量都穩(wěn)定可行的情況下，各種DNA分型方法的關(guān)鍵在于模板DNA的制備。

　　傳統(tǒng)的模板DNA提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細(xì)胞組分，溶解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚-氯仿抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實(shí)驗(yàn)用。早的分離方法是由Blin等[3]根據(jù)Gross-Bellard等提出的原始方案改良并建立的酚抽提法。而標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法是目前常用可靠的方法之一，所獲的DNA純度高，可滿足臨床各種檢測(cè)需要，但操作繁瑣，耗時(shí)較長，重蒸飽和酚處理復(fù)雜，有污染和毒性作用。常規(guī)粗提如煮沸法等所提取的DNA質(zhì)量難以滿足HLA基因分型的要求，而鹽析法不可避免地要處理蛋白酶K，要經(jīng)過水浴步驟。鹽酸胍法初應(yīng)用于有核細(xì)胞的RNA提取，Bowtell等[1]報(bào)道，鹽酸胍法可應(yīng)用于有核細(xì)胞的DNA提取，是一種可快速簡易地提取完整的DNA，可適用于范圍廣泛的各種組織細(xì)胞，進(jìn)行大量樣本提取DNA的理想方法。該法操作較為簡便，沒有重蒸飽和酚處理復(fù)雜，沒有污染和毒性作用，適合臍血庫的大量樣本DNA的提取，并可用于HLA基因分型。由于臍血庫的日入庫標(biāo)本量大，因此提取DNA要求方法操作簡便，易于掌握，同時(shí)要求方法可用于陳舊血樣的DNA提取。在應(yīng)用鹽酸胍法提取臍血DNA的一段時(shí)間后，我們發(fā)現(xiàn)此法存在一些問題需要改進(jìn)，因此針對(duì)其操作較為繁瑣、技術(shù)不易掌握等缺點(diǎn)，進(jìn)行了改良，建立了適合臍血庫中HLA基因分型使用的改良鹽酸胍法。

　　應(yīng)用鹽酸胍法，在用乙醇沉淀DNA的過程中，不易觀察到DNA的析出，用玻棒或加樣槍吹吸過程中，容易將DNA打散，使DNA不纏繞成團(tuán)，造成DNA的損失。此步驟技術(shù)不易掌握。臍血入庫有一定的標(biāo)準(zhǔn)，白細(xì)胞數(shù)都在比較恒定的范圍內(nèi)，理論上同一方法所提取的各DNA的質(zhì)量應(yīng)較為恒定。由本研究結(jié)果可知，此法所提的DNA質(zhì)量不穩(wěn)定，其原因主要是這個(gè)步驟不易掌握。針對(duì)此種情況，在改良鹽酸胍法中，改用氯仿抽提后，再用異丙醇沉淀DNA，這樣就避免上述的技術(shù)問題的發(fā)生。

　　臍血經(jīng)冷凍保存后，紅細(xì)胞破裂后所形成的碎片中有大量脂肪、蛋白質(zhì)，且呈不均勻塊狀的分布，造成抽提困難，難以得到高純度的DNA。在改良鹽酸胍法中，增加氯仿抽提后，再用異丙醇沉淀DNA，這樣可減少因標(biāo)本不新鮮所致的蛋白質(zhì)和脂肪增多的影響，增加DNA的純度和濃度。

　　在臍血庫中，因?yàn)槟氀旧韺⒈４鎮(zhèn)溆?，提供給HLA配型的血量相對(duì)較少，而且需要備份臍血的DNA樣本供日后復(fù)查核對(duì)。改良鹽酸胍法對(duì)增加3倍血量所用的試劑只需1.5倍，這樣不僅備份了臍血DNA，而且減少了工作量和試劑，耗材的費(fèi)用也降低。

　　用異丙醇沉淀DNA可使所有實(shí)驗(yàn)步驟在1.5 ml離心管中進(jìn)行。因?yàn)橛靡掖汲恋硪?倍體積于待沉淀物的乙醇，而異丙醇則為1∶1，這有利于大量樣品的提取。

　　鹽酸胍法和改良鹽酸胍法進(jìn)行HLA基因分型都獲成功。鹽酸胍法所提取的DNA所擴(kuò)增出來的產(chǎn)物有少量的非特異性條帶出現(xiàn)，對(duì)HLA基因分型有一定的影響，而改良鹽酸胍法使DNA的純度和濃度有了很好的提高，所提取的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在增加特異性方面有很大的改進(jìn)。

　　因此，改良鹽酸胍法不但操作簡便，成本下降，而且在少血量中提取出高純度的DNA，完全能滿足臍血庫內(nèi)HLA基因分型技術(shù)的要求。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　1 Bowtell DD. Rapid isolation of eukaryotic DNA.Anal Biochem，1987;162: 463-465

　　2 Charron D，F(xiàn)auchet R.Twelfth international histocompatiblity workshop handbook.Pairs: 12th IHWC Secretariat，1995:17-21

　　3 Blin N，Stafford DW.A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes.Nucleic Acids Res，1976; 3: 2303-2308