組織芯片簡(jiǎn)易制作方法及免疫組化有效性分析

　作者：漆楚波,朱潤(rùn)慶,夏和順,王明偉　　作者單位：武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室;湖北省腫瘤醫(yī)院病理科

　　【摘要】 目的探索一種組織芯片的簡(jiǎn)易制作方法，并對(duì)它的有效性進(jìn)行分析。方法在實(shí)驗(yàn)中探索出組織芯片的制作方法，收集乳腺癌病例124例，制作成直徑1.6cm的組織芯片，進(jìn)行雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及cerBb2 受體免疫組化染色，同時(shí)與普通切片的免疫組化染色結(jié)果對(duì)比，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果組織芯片與普通切片的ER、PR及cerBb2 染色積分(0 ～ 7 分)顯著相關(guān)，ER、PR 及cerBb2的表達(dá)(陽(yáng)性/ 陰性)一致率分別達(dá)94.35%、93.55%和91.94%。比較組織芯片與普通切片的ER、PR及cerBb2的表達(dá)，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，即組織芯片的結(jié)果與普通切片的結(jié)果是一致的。結(jié)論自制1.6mm 直徑的組織芯片在進(jìn)行免疫組化染色時(shí)能夠代表普通切片,自制組織芯片的方法可靠有效。

　　【關(guān)鍵詞】 組織芯片;簡(jiǎn)易制作方法;雌激素受體;孕激素受體;cerBb2受體;免疫組化

　　A Simple Making Method of Tissue Microarray and Validation Study on Immunohistochemistry

　　QI Chubo，ZHU Runqing，XIA Heshun， WANG Mingwei

　　Department of Pathology, Basic Medical School of Wuhan University,Wuhan 430071,China;Department of Pathology, Hubei Cancer Hospital

　　Abstract：ob[x]jectiveTo search a simple making mothd of tissue microarray and evaluate its validation. MethodsA new, simple and easy method was designed to improve the technology of TMA during the experiment. Tissue microarrays with 1.6mm in diameter tissue core were constructed from 124 cases of breast cancer. The tissue microarrays were stained for oestrogen receptor(ER),progesterone receptor(PR)and cerBb2 using immunohistochemistry.At the same time the stains on the tissue microarrays were compared with that from the full tissue sections. ResultsA highly significant association was observed between the staining scores(0 ～ 7)obtained from the full tissue sections and from the tissue microarrays. Concordance for the receptor status(positive / negative)of the whole section and the tissue core were 94.35% for ER，93.55% for PR.and 91.94% for cerBb2.The discordance between full section and tissue microarrays was studied using Two  Related  Samples tests and the result had no statistical significance(P>0.05) . ConclusionTissue microarays with 1.6mm in diameter tissue core made by simple method can represent full tissue section on immunohistochemistry study.We believe our method of tissue microarray is a reliable and valid

　　Key words：Tissue microarrays;Making method;Oestrogen receptor;Progesterone receptor;cerBb2 receptor;Immunohistochemistry

　　0引言

　　組織芯片(tissue chip)又稱(chēng)組織微陣列(tissue microarray TMA)。它是將數(shù)十至上千個(gè)小組織按照設(shè)計(jì)，整齊地排放在一張載玻片上制成組織切片的技術(shù)。這一技術(shù)由美國(guó)國(guó)立癌癥研究院的Kononen等[1]于1998年在Nature Medicin上報(bào)道。它是繼基因芯片、蛋白質(zhì)芯片之后出現(xiàn)的又一種重要的生物芯片技術(shù)。由于現(xiàn)有組織芯片設(shè)備昂貴且操作繁瑣、取樣點(diǎn)樣本精度低等缺點(diǎn)，影響了組織芯片技術(shù)在病理診斷和研究中應(yīng)用。我們參閱大量資料，自行設(shè)計(jì)工具，成功制作了高質(zhì)量組織芯片。根據(jù)工作需要，我們選擇比較乳腺癌組織芯片和普通切片中免疫組化的差別，來(lái)判斷組織芯片的有效性，以期能用組織芯片技術(shù)提高工作效率。

　　1材料與方法

　　1.1供體蠟塊的選擇收集湖北省腫瘤醫(yī)院病理科2005年12月~2006年6月診斷為乳腺癌并做過(guò)受體檢測(cè)的病例160例，復(fù)查組織切片，包括蘇木素-伊紅(HE)和雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、cerBb2受體染色切片，一些組織蠟塊太薄的病例被排除，終有124例入選本實(shí)驗(yàn)，均為4%甲醛固定、石蠟包理的組織。其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌101例，浸潤(rùn)性小葉癌14例，大汗腺癌1例，化生性癌1例，髓樣癌7例。

　　1.2組織芯片的構(gòu)建

　　1.2.1簡(jiǎn)易工具的制作(1) 打孔針和取樣針的制作打孔針和取樣針均可以用帶實(shí)芯針的穿刺針自己磨制。一套針有四件，兩個(gè)空心針及配套的兩個(gè)實(shí)心針芯。針徑可以是0.6~2.0mm，須注意打孔針徑比取樣針徑小1號(hào)(即打孔針的外徑與取樣針的內(nèi)徑一致)，以便取樣組織的直徑和打孔孔徑一致，以防組織芯孔與受體組織連接不緊脫落。我們使用的取樣針直徑是1.6mm，打孔針和取樣針的外周套彩色塑料膜以標(biāo)記針進(jìn)入蠟塊的深度，打孔針打孔的深度要比取樣針深1.0mm。有人報(bào)道是采用微雕開(kāi)窗標(biāo)記刻度技術(shù)，我們認(rèn)為不可取，因?yàn)獒樣镁貌讳h利時(shí)要磨，會(huì)影響刻度[2]。(2) 通量定位模板的制作根據(jù)自己的需要，可以使用不同直徑的針制作不同通量的模板(好用透明材料)，孔間距可以為1.0mm到2.0mm，建議剛開(kāi)始操作不熟練時(shí)間距大一點(diǎn)(2.0mm)，四周留白距離大一點(diǎn)(3.0mm)，以防止打孔打歪或石蠟塊斷裂，影響效果。模板的四周好是三周都有擋板，模板的內(nèi)徑大小和受體臘塊相同，以便模板卡在受體蠟塊上，操作起來(lái)很輕松。我們使用的通量模板有兩種：①通量陣列5×7，取樣直徑2.0mm，間距2.0mm;②通量陣列7×9，取樣直徑1.5mm， 間距1.5mm;蠟塊大小統(tǒng)一為30.0mm×25.0mm，厚度15.0mm，便于管理。

　　1.2.2TMA制作方法(1) 受體蠟塊的制作及打孔①可以使用熔點(diǎn)在60℃～62℃普通切片純凈石蠟制作，依據(jù)自己的需要設(shè)計(jì)制作規(guī)格與模板大小一致的各種包埋框;②倒入融化的液體石蠟，在蠟塊的表面加上普通塑料包埋底盒，以便切片時(shí)固定蠟塊和編號(hào)，也可直接用標(biāo)簽紙蠟封編號(hào)(切片時(shí)有可能使底盒與蠟塊脫落，但蠟塊依然很規(guī)整不影響切片)。澆注熔化石蠟后開(kāi)始計(jì)時(shí)，40～50min后(具體時(shí)間可能因?yàn)槭覝氐牟煌煌?蠟塊成型并且處于未完全固體化狀態(tài)，剝離包埋框，開(kāi)始打孔;③打孔時(shí)先將定位模板卡住受體蠟塊固定，然后用對(duì)應(yīng)型號(hào)的打孔針通過(guò)定位模板上的陣列孔打孔，深度為6.0mm。打孔需快速進(jìn)行，否則蠟塊變冷變硬時(shí)容易發(fā)裂，此時(shí)也可以放入攤片機(jī)水箱中(水溫46℃)水浴加熱3～5min，使蠟塊受熱變軟而不易發(fā)裂。(2)待取位點(diǎn)標(biāo)記及供體蠟塊的制作 這是技術(shù)創(chuàng)新的關(guān)鍵。由于多數(shù)取材組織是四方形的，很少是不規(guī)則的，使我們?cè)?a href="http://www.yappets.com/product/keywords/273.html" title="顯微鏡" target="_blank" class="hl-keyword">顯微鏡下閱片后很難回到蠟塊上的某一點(diǎn)取材，常用方法是在玻片上畫(huà)圈標(biāo)記，再回到組織蠟塊上目測(cè)找位點(diǎn)，這種方法由于取樣位點(diǎn)象限不好確定而需要多處取樣，這大大增加了我們的工作量和成本。我們的解決方法是坐標(biāo)定位法準(zhǔn)確定位：①在取材時(shí)用大頭針在蠟塊的左上象限1/3處打孔做標(biāo)記(也可在已成形的蠟塊上用小針打孔標(biāo)記)，作為XY軸的原點(diǎn)。②我們閱片時(shí)以此打孔點(diǎn)位為原點(diǎn)，分別在顯微鏡下測(cè)出我們要取材的位點(diǎn)在水平軸(X軸)和垂直軸(Y軸)上的坐標(biāo)距離，再返回到蠟塊上相應(yīng)的坐標(biāo)位點(diǎn)做標(biāo)記，取樣。從而實(shí)現(xiàn)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的精確位點(diǎn)取樣，僅一次就可成功。(3)供體蠟塊的取樣①供體蠟塊取樣前需加熱，方法有烤箱加熱和水浴加熱，我們認(rèn)為水浴更方便，且易于控制。水溫46℃～48℃，加熱5～10min;②依據(jù)前面測(cè)量的坐標(biāo)找到需要取材的位點(diǎn)，用采樣針在供體蠟塊欲取出部位上打孔采樣，深度5.0mm(比受體蠟塊孔淺1.0mm)，深度先在針上用彩色塑料膜標(biāo)記，采樣時(shí)需緩慢用力，防止供體蠟塊裂開(kāi)，到達(dá)要求的深度后要旋轉(zhuǎn)兩周以便針芯充滿(mǎn)。③在陣列蠟塊(受體蠟塊)上找到要填入的位點(diǎn)，用實(shí)心針芯緩緩?fù)瞥?，?zhǔn)確植入，使組織芯的平面和蠟塊的基本一致。④為了更方便準(zhǔn)確的取樣，我們制作了簡(jiǎn)單的取樣定位工具，制作方法：在兩個(gè)內(nèi)空的矩形直角邊上刻上精確刻度，取樣時(shí)用兩個(gè)矩形相對(duì)的直角兩邊組成一個(gè)中空矩形，按照前面顯微鏡下測(cè)量的距離和方向，以打孔點(diǎn)為矩形的一個(gè)直角的頂點(diǎn)，對(duì)角頂點(diǎn)就是要取樣的位點(diǎn)的精確位置。以上創(chuàng)新方法我們?nèi)∶麨槎S坐標(biāo)定位矩形模板取樣法。(4)陣列位點(diǎn)信息記錄①在植入組織芯時(shí)在左上象限非對(duì)角線(xiàn)上的某一個(gè)位點(diǎn)要空出，以便識(shí)別陣列的方位。有報(bào)道采用植入腦組織來(lái)定位，我們實(shí)踐后認(rèn)為還是不植入方便，因?yàn)?一方面不植入組織芯的陣列，我們?nèi)庋劬涂梢源_定方位，而植入腦組織的陣列要在顯微鏡才能確定;二是腦組織在攤片時(shí)有時(shí)容易散開(kāi)，從而增加確定方位難度。②信息記錄采用二維記錄方式，精確記錄每一位點(diǎn)的信息。水平方向從左到右每個(gè)點(diǎn)坐標(biāo)標(biāo)記為A、B、C、…，垂直方向每個(gè)點(diǎn)坐標(biāo)標(biāo)記為1、2、3…，這樣每個(gè)位點(diǎn)都有由一個(gè)由字母和數(shù)字組成的坐標(biāo)，如(A3)，(B5)，(G2)等等?？梢栽诘怯洷旧嫌涗浢總€(gè)位點(diǎn)的信息，很方便的建立組織芯片庫(kù)。(5)陣列蠟塊的處理陣列制作完畢后，將陣列蠟塊含有組織的一面平放在一玻璃板上，置于56℃恒溫箱內(nèi)，每5 min觀(guān)察一次，待蠟塊和玻璃板中間出現(xiàn)液體狀的石蠟把蠟塊取出，置于冰箱內(nèi)冰塊上冷卻。有報(bào)道是在常溫下冷卻，我們實(shí)踐和比較后認(rèn)為冰箱內(nèi)冷卻效果更好，因?yàn)椋撼叵吕鋮s蠟塊必須底面(有組織芯片的面)朝上，這時(shí)液體石蠟容易流出，使蠟塊的邊角變鈍，這樣影響邊角的組織芯的切片。(6)切片冰臘塊好后以4μm厚切片，裱貼于經(jīng)2% 3氨丙基三乙氧硅烷(APES)丙酮液處理過(guò)的載玻片上。微陣列蠟塊的切片用德國(guó)徠卡一次性刀片在徠卡切片機(jī)上切片， 與常規(guī)組織切片基本相同，但是因?yàn)橄瀴K內(nèi)的組織塊多，在裱片時(shí)操作要輕，速度掌握適宜，否則容易離斷或組織陣列偏移，另外，還要注意水溫，過(guò)低切片展不開(kāi)，過(guò)高易拉長(zhǎng)，拉斷，保持在48℃左右較合適。用一次性切片刀比用普通厚鋼刀切片質(zhì)量要好。共制作臘塊4個(gè)，各切片3張共12張切片，每張切片留一個(gè)為定位用空白點(diǎn)，其余62個(gè)為有效組織位點(diǎn)。372例免疫組化只做了12張玻片。工作量相當(dāng)于以前免疫組化的3%。

　　1.3免疫組織化學(xué)標(biāo)記將組織芯片蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4μm，裱貼于A(yíng)PES丙酮液處理過(guò)的載玻片上。60℃烤箱內(nèi)烤片1h，脫蠟入水，3 % H2 O2室溫孵育10min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原100℃ 15min，一抗均為單克隆即用型抗體，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)采用非生物素即用型EliVision TM二步法，DAB顯色?？贵w及DAB顯色劑及即用型代免疫組化ElivisionTM plus 廣譜試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

　　1.4染色結(jié)果的判斷ER和PR均為細(xì)胞核著色，cerBb2為胞膜著色。陽(yáng)性判斷采用快速積分法[3]，首先將染色強(qiáng)度打分:0分為未著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比打分:陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，> 75%為4分。后將染色強(qiáng)度的得分與百分比的得分相加。根據(jù)兩種方法評(píng)定:0～3分為陰性，4～7分為陽(yáng)性。

　　1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用直線(xiàn)相關(guān)分析比較組織芯片與普通切片之間的ER、PR及cerBb2得分的相關(guān)性，采用配對(duì)的卡方檢驗(yàn)檢測(cè)組織芯片與普通切片之間的ER、PR及cerBb2表達(dá)(陰性/陽(yáng)性)一致率。

　　2結(jié)果

　　2.1組織芯片質(zhì)量所有組織芯片組織排列整齊，12張切片，共744個(gè)組織位點(diǎn)，只有35個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了部分缺失，且均低于50%，不影響結(jié)果的判斷。由于我們采取的是精確位點(diǎn)取樣，未出現(xiàn)無(wú)效組織。

　　2.2免疫組織化學(xué)染色普通切片與組織芯片相比，兩者的ER、PR、cerBb2得分顯著相關(guān)(P<0.001).

　　組織芯片與普通切片 ER. PR 和cerBb2得分的相關(guān)性

　　普通切片ER、 PR和cerBb2的陽(yáng)性率分別是72.58%、65.32 %和42.74%，組織芯片的ER、 PR和cerBb2的陽(yáng)性率分別是75.00%、69.35%和47.58%組織芯片與普通切片之間的ER、 PR和cerBb2的陽(yáng)性率表達(dá)(陰性/陽(yáng)性)一致率分別為97.58%、95.97%和95.16%。若采用陰性/弱陽(yáng)性/陽(yáng)性系統(tǒng)評(píng)定染色結(jié)果，則兩者之間的ER、PR及cerBb2表達(dá)一致率分別為94.35%、93.55%和91.94%。盡管兩者一致率很高，但并不是完全一致，因此我們選用配對(duì)卡方檢驗(yàn)檢測(cè)它們之間的ER、PR和cerBb2表達(dá)是否有差異。

　　組織芯片與普通切片ER、PR和cerBb2表達(dá)結(jié)果

　　ER、PR和cerBb2在組織芯片和普通切片上的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即組織芯片有很好的代表性。

　　3討論

　　組織芯片、基因芯片和蛋白質(zhì)芯片并稱(chēng)為分子遺傳學(xué)的三大芯片技術(shù)，而組織芯片結(jié)合了形態(tài)學(xué)、基因?qū)W和蛋白質(zhì)學(xué)，能夠同時(shí)分析成百上千種組織和細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)與臨床疾病的關(guān)系[4]。因此，開(kāi)展組織芯片技術(shù)建立腫瘤和正常組織芯片庫(kù)有著重大的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1.6mm直徑的組織芯片從總體是能夠代表普通組織切片進(jìn)行免疫組化研究的。如果照標(biāo)準(zhǔn)的程序制作組織芯片(特別是準(zhǔn)確選取組織芯)，1.6mm直徑的組織芯片代表性不會(huì)出現(xiàn)明顯偏差，能夠避免無(wú)效組織芯片的出現(xiàn)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，并不是組織芯片上每一個(gè)組織芯都能完全代表其原來(lái)的普通切片，但這細(xì)小的差異并不影響免疫組化的結(jié)果，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有意義，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，單一數(shù)據(jù)的變異不會(huì)影響總體的估計(jì)，本研究的觀(guān)察結(jié)果與Kallioniemi等相同[5]，因此，只要選擇病例得當(dāng)完全可以利用組織芯片免疫組化取代常規(guī)免疫組化，從而提高工作效率和科研水平。本實(shí)驗(yàn)的切片和免疫組化的工作量?jī)H常規(guī)的3%，節(jié)約了試劑也減少了實(shí)驗(yàn)誤差。組織芯片由于它的高通量，平行性和科學(xué)性無(wú)疑會(huì)給科學(xué)發(fā)展的飛躍提供一個(gè)非常的平臺(tái)，由于這項(xiàng)技術(shù)還不很成熟，需要專(zhuān)門(mén)的昂貴設(shè)備，且可操作性不好，國(guó)內(nèi)對(duì)它的研究還處于起步階段，我們?cè)O(shè)計(jì)制作的組織芯片質(zhì)量較高，技術(shù)成熟，成本低廉(已申請(qǐng)專(zhuān)利，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?00710040165.1)，非常有利于組織芯片技術(shù)在我國(guó)的發(fā)展，應(yīng)用該技術(shù)可以迅速地在全國(guó)建立系列組織庫(kù)。我們技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：(1)依托石蠟切片的現(xiàn)有設(shè)備，自己設(shè)計(jì)和制作各種工具和設(shè)備，成本低，可操作性強(qiáng)，非常有利于開(kāi)展工作。(2)成功實(shí)現(xiàn)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的精確位點(diǎn)取材，從而避免了以前報(bào)道的由于腫瘤異質(zhì)性所造成的無(wú)效芯片偏差。(3)精確記錄每一個(gè)芯片位點(diǎn)的信息，便于以后試驗(yàn)。能夠有效的建立系列正常和腫瘤組織芯片庫(kù)。(4)我們的各種組織芯片蠟塊全部統(tǒng)一大小規(guī)格，能夠與包埋常用的底板兼容，方便了切片，也能夠使技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，便于以后計(jì)算機(jī)閱片。(5)在實(shí)踐中可以很方便的組合所需要的各種組織芯片。TMA技術(shù)的提出，使以免疫組織化學(xué)和原位PCR為代表的分子病理學(xué)研究進(jìn)一步邁向規(guī)范化、科學(xué)化和高技術(shù)化[6]，TMA具有普通切片無(wú)法比擬的優(yōu)越性：非常微小(直徑0.6～2.0mm)，數(shù)量多(目前可達(dá)1 000個(gè)點(diǎn)陣)，形狀規(guī)則，排列有序，具有高通量和平行性，檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性和可比性強(qiáng)，信息量大，效率高，消耗試劑少。在對(duì)腫瘤的分子改變與臨床病理特征的聯(lián)系研究上，TMA將提供巨大幫助，同時(shí)TMA也可用于基因產(chǎn)物的篩選、生物試劑的測(cè)試、病理質(zhì)量的控制及標(biāo)準(zhǔn)化、教學(xué)和考試以及制作微縮組織學(xué)和病理學(xué)圖譜。隨著TMA技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤及正常組織庫(kù)的建立，TMA的構(gòu)建形成系列化，病理學(xué)的作用將面臨轉(zhuǎn)變，即在腫瘤分型時(shí)不再把重點(diǎn)放在組織學(xué)形態(tài)改變上，而是從多方面、多水平地為臨床治療提供更多資料。相信在不久的將來(lái)，TMA技術(shù)在腫瘤的診斷和研究領(lǐng)域中將發(fā)揮更加重要的作用。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1]Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrys for highthroughput molecular profiling of tumor specimens[J]. Nat Med,1998,4:844847.

　　[2]蔣時(shí)紅，劉旺根，王雪萍，等. 組織芯片手工制作工具[J]. 解剖學(xué)雜志. 2006, 29(2):145.

　　[3]Barnes DM, Harris WH, Smith P，et al .Immunohistochemical determination of oestrogen receptor: comparison of different methods of staining and correlation with clinical outcome of breast cancer[J].Br J Cancer, 1996, 74(9):14451451.

　　[4]Torhorst J, Bucher C, Kononen J, et al. Tissue microarrays for rapid li[x]nking of molecular changes to clinical endpoints[J].Am J patlol, 2001，159( 6 ) : 22492256.

　　[5]Kallioniemi O，Wagner U，Kononen J, et al. Tissue microarray technology for high-throghput molecular profiling of cancer[J].Hum Mof Genetics, 2001, 10:657662.

　　[6]Hsu FD, Sielsen TO, Alkushi A, et al. Tissue microarravs are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry[J]. 2002, 15(12):13741378