白細(xì)胞介素-17對人滑膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因表達(dá)的影響

作者：王加剛1,黃永輝1,焦志軍2　　作者單位：江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.骨科; 2.檢驗科， 江蘇 鎮(zhèn)江

　　【摘要】目的：探討白細(xì)胞介素-17(IL-17)對人滑膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及意義。方法：收集急性外傷性半月板損傷患者關(guān)節(jié)滑膜組織(8例)，采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代滑膜細(xì)胞培養(yǎng)，加入不同濃度的重組人IL-17，培養(yǎng)12,24及36 h后收集細(xì)胞并抽提RNA，應(yīng)用實時PCR檢測滑膜細(xì)胞MMP-9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：組織塊培養(yǎng)法可以獲得高純度的人滑膜細(xì)胞，且表達(dá)一定量的MMP-9。以10 ng/ml的IL-17作用滑膜細(xì)胞12 h后MMP-9 mRNA表達(dá)增加，24h到達(dá)高峰，36 h后明顯下降(F=16.06，P<0.05)。以1,10,20 ng/ml的IL-17作用滑膜細(xì)胞24 h均上調(diào)滑膜細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)，且存在明顯的劑量依賴關(guān)系，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.31，P<0.05)。結(jié)論：IL-17能夠上調(diào)人滑膜細(xì)胞MMP-9基因的表達(dá)，在關(guān)節(jié)局部炎性機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。

　　【關(guān)鍵詞】 白細(xì)胞介素-17; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9; 滑膜細(xì)胞

　　[Abstract]　ob[x]jective： To investigate the effect of interleukin-17 on gene ex[x]pression of matrix me[x]talloproteinase-9(MMP-9) in human fibroblast-like synoviocytes. Methods： Synoviocyte were isolated from synovial tissues of patients with meniscus injury (n=8) and stimulated with recombinant IL-17 for 12， 24 h and 36 h. The ex[x]pression of MMP-9 mRNA in human fibroblast-like synoviocytes was determined by real-time PCR. Results： The isolated cells accorded with the characteristics of fibroblast-like synoviocytes.The MMP-9 mRNA ex[x]pression in human fibroblast-like synoviocytes which were stimulated by 10 ng/ml IL-17 increased in 12 h， peaked in 24 h， then decreased significantly after 36 h (F=16.06，P<0.05). IL-17 could up-regulated the MMP-9 ex[x]pression in human fibroblast-like synoviocytes stimulated by 1,10 and 20 ng/ml IL-17 for 24 h，and the ex[x]pression level was dose dependent (F=24.31，P<0.05). Conclusion： IL-17 may play an important role in the development of joint inflammation via up-regulating the MMP-9 ex[x]pression.

　　[Key words]　interleukin-17; matrix me[x]talloproteinase-9; fibroblast-like synoviocytes

　　白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)主要是T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的致炎性，能促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1、IL-6，刺激滑膜細(xì)胞釋放前列腺素E2(PGE2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成氧化亞氮(NO)等生物學(xué)功能[1-2]。但其對滑膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的調(diào)節(jié)目前報道較少，本研究通過培養(yǎng)正常人原代滑膜細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度重組人IL-17刺激，觀察IL-17對人滑膜細(xì)胞MMP-9基因表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步探討MMP-9在關(guān)節(jié)局部炎癥發(fā)生中的作用提供依據(jù)。

　　1　材料與方法

　　1.1　對　象

　　收集2010年3至4月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院在關(guān)節(jié)鏡下所取的正常成人膝關(guān)節(jié)外傷性半月板損傷的滑膜組織(8例)，其中男5例，女3例，平均年齡28.6歲，術(shù)前3周內(nèi)未使用免疫抑制劑并且無自身免疫性疾病。以上標(biāo)本獲取時都得到患者術(shù)前的知情同意。

　　1.2　主要試劑

　　熒光標(biāo)記的抗體：重組人IL-17(Peprotech公司);FITC標(biāo)記的抗人CD14、PE標(biāo)記的抗人CD90(EBioscience公司);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液(Gibco);胰蛋白酶(Sigma公司);RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒(TaKaRa公司);引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

　　1.3　方　法

　　1.3.1　人滑膜細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

　　將取下的滑膜組織用含抗生素(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的PBS沖去血跡，剪碎成1 mm3的小塊，以間距5 mm左右放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，再把培養(yǎng)瓶放置于37℃，5%CO2的孵育箱內(nèi)，待4 h后組織小塊貼附，緩緩加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，24 h后補(bǔ)加4 ml培養(yǎng)液。2 天后換培養(yǎng)液，除去未貼壁的組織塊。以后2～3天換液1次，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面85%面積時，即可消化傳代。

　　1.3.2　滑膜細(xì)胞類型鑒定

　　用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。流式細(xì)胞術(shù)表面標(biāo)志鑒定：取第3～5代的成纖維樣滑膜細(xì)胞，消化后，PBS洗滌，分別與FITC標(biāo)記的鼠抗人CD14、PE標(biāo)記的CD90單克隆抗體及對應(yīng)的同型對照抗體于室溫孵育15 min，洗滌細(xì)胞，采用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果分析應(yīng)用Cellquest軟件。

　　1.3.3　IL-17對滑膜細(xì)胞的作用

　　取第3～5代培養(yǎng)的人滑膜細(xì)胞，消化后分為2份，均以5 ×104 個細(xì)胞/孔傳代于24孔板中，每孔加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μl，置于37 ℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁。其中一份加入IL-17，使其終濃度分別為1,10,20 ng/ml，置于37℃，5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。另一份加入IL-17，使其終濃度為10 ng/ml，置于37℃，5%CO2孵育箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)12,24及36 h。

　　1.3.4　細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

　　采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，取總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，均按試劑盒說明書操作。

　　1.3.5　定量PCR檢測MMP-9 mRNA表達(dá)

　　取上述cDNA，采用TaKaRa 公司SYBR? Premix Ex Taq?試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系為20 μl，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。引物由上海生工生物工程公司合成，MMP-9基因及內(nèi)參引物序列。表達(dá)水平以其與內(nèi)參β-肌動蛋白的比值表示，所用定量PCR儀型號為羅氏Lightcycler。MMP-9基因及內(nèi)參引物序列。

　　2　結(jié)　果

　　2.1　滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

　　采用組織塊法培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，培養(yǎng)6天后在其邊緣有橢圓形、三角形或梭形成纖維樣細(xì)胞長出(圖1A),20天左右細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面85%面積，消化傳至3～5代的細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞為長梭形、形態(tài)均一、排列規(guī)則(圖1B)。用兩種特異性細(xì)胞分化抗原CD14，CD90標(biāo)記后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：這些細(xì)胞均一地表達(dá)CD90(>95%)、而不表達(dá)CD14(<1.3%)，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞是滑膜成纖維細(xì)胞。

　　2.2　不同濃度IL-17對滑膜細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

　　取第3～5代培養(yǎng)的人滑膜細(xì)胞，加入1,10，20 ng/ml 的IL-17共培養(yǎng)24 h后檢測MMP-9 mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(不加IL-17)相比，3種濃度的IL-17均能上調(diào)MMP-9的表達(dá)，隨著IL-17濃度的增加，MMP-9的表達(dá)水平也逐漸增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)(F= 24.31，P<0.05)?！』ぜ?xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定*：設(shè)對照組MMP-9表達(dá)量為1　不同濃度IL-17對滑膜細(xì)胞MMP-9 mRNA相對表達(dá)量的影響

　　2.3　IL-17誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞不同時間MMP-9 mRNA表達(dá)量

　　為動態(tài)觀察IL-17對滑膜細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響，固定IL-17濃度為10 ng/ml，培養(yǎng)12,24,36 h后收集細(xì)胞檢測MMP-9 mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)作用12 h后MMP-9 mRNA表達(dá)即增加，24 h到達(dá)高峰，36 h后明顯下降(F=16.06 ，P<0.05)。*：設(shè)對照組MMP-9表達(dá)量為1　IL-17誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞不同時間MMP-9 mRNA表達(dá)量

　　3　討　論

　　近年研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子和多肽生長因子在關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的正常結(jié)構(gòu)及功能的維持方面起著重要作用，促炎因子與抑制炎癥的因子之間保持著平衡，一旦這種平衡發(fā)生偏移則可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。IL-17被認(rèn)為有較強(qiáng)的促炎作用，尤其是發(fā)現(xiàn)一群分泌IL-17的CD4+細(xì)胞并命名為Th17細(xì)胞之后，其在關(guān)節(jié)局部炎癥中的作用再次成為研究熱點[3-5]。

　　本研究在前期發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Th17細(xì)胞明顯增多的基礎(chǔ)上[6]，進(jìn)一步探討IL-17在關(guān)節(jié)炎癥局部的促炎作用。本實驗用組織塊法培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，操作簡單，換液次數(shù)少，減少了污染的機(jī)會。通過多次貼壁，可得到較純的滑膜成纖維樣細(xì)胞。近年研究證實細(xì)胞因子分泌異常，并導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的失衡是骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨變性的重要原因之一[7-8]。我們采用重組的人IL-17細(xì)胞因子，作用于純化的滑膜成纖維樣細(xì)胞，觀察其對滑膜細(xì)胞分泌MMP-9的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滑膜細(xì)胞在沒有IL-17刺激的情況下表達(dá)少量的MMP-9，在IL-17存在的情況下，MMP-9表達(dá)增多，且隨著IL-17濃度的升高，MMP-9表達(dá)明顯增多，表明IL-17與MMP-9 mRNA的表達(dá)呈劑量依賴關(guān)系。動態(tài)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17作用12 h后MMP-9 mRNA表達(dá)即增加，24 h到達(dá)高峰，36 h后則明顯下降。IL-17對關(guān)節(jié)軟骨作用的可能機(jī)制，一是IL-17作用于滑膜細(xì)胞，促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶如MMP-9，兩者再作用于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞。文獻(xiàn)報道IL-17受體缺乏的大鼠與對照組相比，在同樣的關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)條件下，前者軟骨細(xì)胞的死亡及軟骨表面侵蝕明顯受到抑制，其滑膜細(xì)胞表達(dá)IL-1，MMP-3、9、13也減少[9]，間接證明了IL-17促進(jìn)MMP-9基因表達(dá)的重要作用。二是IL-17直接作用于關(guān)節(jié)軟骨，導(dǎo)致其功能障礙[10]。Lubberts等[11]研究發(fā)現(xiàn)，向正常小鼠的膝關(guān)節(jié)單獨注射IL-17，足以引起軟骨損傷，并且還能加重滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞，用抗IL-17血清中和膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)的IL-17，能明顯減輕滑膜炎的發(fā)病程度。

　　本研究僅探討了IL-17對正常人滑膜細(xì)胞表達(dá)MMP-9的調(diào)節(jié)作用，下一步實驗將探討其對骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞產(chǎn)生各類MMPs的調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為全面了解IL-17在關(guān)節(jié)炎癥局部的作用提供依據(jù)。