急性髓細胞白血病FLT3ITD基因突變的檢測及其臨床意

     作者：尹列芬,王曄,姚錦,黃桂云,瞿曉媛　　作者單位：昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院血液科，云南昆明 650101

　　【摘要】目的 探討急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者人Fms樣酪氨酸激酶3內部串聯(lián)重復(Fmslike tyrosine kinase3intenal tandem duplication, FLT3ITD)基因突變及其臨床意義。方法 采用聚合酶鏈反應變性高效液相色譜(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chromatography, PCRDHPLC)方法檢測60例初治AML患者和10例對照組骨髓FLT3ITD基因突變。結果 60例AML患者FLT3ITD突變陽性率21.67%(13/60)，10例對照組均未檢測到該突變;FAB各亞型FLT3ITD突變率不同，有M3型突變率較高的趨勢;FLT3ITD陽性組外周血白細胞數(shù)、骨髓白血病細胞比例高于FLT3ITD陰性組(P<0.01);FLT3ITD陽性組完全緩解(CR)率低于FLT3ITD陰性組(P<0.05)。結論 FLT3ITD基因突變多見于M3患者，F(xiàn)LT3ITD陽性者具有外周血白細胞數(shù)、骨髓白血病細胞比例高、CR率低的特點。FLT3ITD基因突變可作為預測AML預后的一個指標。

　　【關鍵詞】 急性髓細胞白血病;FLT3;內部串聯(lián)重復;基因;聚合酶鏈反應變性高效液相色譜技術

　　Detection and clinical significance of FLT3 internal tandem

　　duplication mutation in acute myeloid leukemiaYIN Liefen, WANG Ye, YAO Jin, HUANG Guiyun, QU Xiaoyuan, YANG Ling

　　(Department of Hematology, the Second Affiliated Hospital of

　　Kunming Medical College, Kunming 650101, China)ABSTRACT: ob[x]jective To investigate the mutation of FLT3 internal tandem duplication (ITD) in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its clinical significance. Methods The mutation of FLT3ITD in bone marrow samples from 60 patients with de novo AML and 10 control groups was detected by polymerase chain reaction denaturinghigh performance liquid chromatography (PCRDHPLC). Results There were 13 out of 60 (21.67%) AML patients identified with FLT3ITD mutation, which was not identified in 10 of the control groups. Different FAB subtypes of AML had different mutation rate, and M3 had an obviously higher mutation rate than other subtypes. The peripheral white cell count and bone marrow blast cells were significantly higher in patients with FLT3ITD mutation than in those without (P<0.01). The complete remission rate was significantly lower in patients with FLT3ITD mutation than those without (P<0.05). Conclusion FLT3ITD mutation is likely to occur in M3 of AML patients. FLT3ITD mutation is associated with a higher peripheral white cell count and a higher percentage of bone marrow blast cells and a lower complete remission rate compared with those patients without FLT3ITD mutation. The detection of FLT3ITD mutation may be used as an index of AML prognosis.

　　KEY WORDS: acute myeloid leukemia; FLT3; internal tandem duplication; gene; polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography

　　人FLT3是Ⅲ型酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)家族成員的原癌基因，其蛋白產物屬于受體，定位于細胞膜上。在正常人骨髓中，F(xiàn)LT3的表達僅限于CD34+干/祖細胞，該受體與多種胞漿蛋白作用介導一系列細胞內信號傳導，誘導細胞增殖和分化。近來研究發(fā)現(xiàn)FLT3基因的異常表達、突變與急性白血病(acute leukemia, AL)的發(fā)生、發(fā)展、預后有密切關系[13]。酪氨酸激酶受體基因FLT3的內部串聯(lián)重復序列(FLT3 internal tandem duplications, FLT3ITD)是一種FLT3的近膜區(qū)的突變，由NAKAO等[4]研究急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)時，于1996年首先報道。為探討AML患者FLT3ITD的突變情況，我們采用聚合酶鏈反應變性高效液相色譜(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chroma

　　tography, PCRDHPLC)技術檢測60例初治AML患者骨髓FLT3ITD的突變情況并分析其臨床意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究對象 60例初治AML患者，診斷及療效標準參照《血液病診斷及療效標準》[5]。男27例，女33例，中位年齡48歲(18～79歲)。FAB分型為M0 3例，M1 3例，M2 14例，M3 13例，M4 13例，M5 12例，M6 2例，M7 0例。老年AML 30例(年齡>60歲)，非老年AML 30例，正常人及良性血液病患者為對照組共10例(3例健康人，5例缺鐵性貧血患者，2例特發(fā)性血小板減少性紫癜患者)。

　　1.2 實驗方法 采用聚合酶鏈反應變性高效液相色譜(PCRDHPLC)方法。①DNA制備。取患者骨髓液2mL，應用美國Promega公司DNA提取試劑盒抽提總DNA。測定吸光度A260nm/A280nm值，確定DNA的純度及濃度，并以去離子水稀釋DNA樣本為1g/L。②PCR擴增。應用Primer Express V2.0軟件包以13號染色體外顯子14、15設計引物，包括整個近膜區(qū)(JM)和激酶結構起始部分，擴增產物為329bp。引物由上海捷瑞公司合成，正義引物：5′GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC3′;反義引物：5′CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3′。PCR反應體系(50μL)：10×PCR緩沖液5μL，25mmol/L MgCl2 6μL，10mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L正/反義引物各2μL，模板DNA 4μL，Taq DNA酶0.5μL，雙蒸水29.5μL。PCR條件：94℃，5min，1個循環(huán);94℃，45s，56℃，45s，72℃，45s，共循環(huán)35次;72℃延伸10min，1個循環(huán)。③測序分析。部分變性DHPLC分析突變陽性產物：5μL預處理的PCR產物上樣于Transgenomic公司的DNA sep分離柱，然后觀察DHPLC圖譜形態(tài)。發(fā)現(xiàn)異常的圖譜形態(tài)PCR產物，純化后測序(由大連寶生物生物公司幫助完成)，分析各FLT3ITD序列。

　　1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。計量資料在作t檢驗、方差分析前先進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，單變量兩組資料采用t檢驗，方差不齊者采用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

　　2 結 果

　　2.1 AML患者FLT3/ITD基因突變的檢測 60例初發(fā)AML患者，13例FLT3ITD突變陽性患者(21.67%)，其中M2 21.4%(3/14)，M3 30.8%(4/13)，M4 23.1%(3/13)，M5 25.0%(3/12)，M0、M1、M6、M7均未檢測到該突變，有M3型突變率較高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。本實驗檢測的突變均為雜和突變，各例突變區(qū)域大小不等(6～100bp)，均為框內突變。10例對照組均未檢測到突變。

　　2.2 FLT3ITD陽性AML患者臨床特征 60例初治AML組中，13例FLT3ITD突變陽性，其中女8例(占25.0%)，男5例(占17.9%)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);30例老年AML組，8例 FLT3ITD突變陽性，突變陽性率26.7%，30例非老年AML組，5例FLT3ITD突變陽性，突變陽性率16.7%，二者相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。FLT3ITD陽性AML患者的實驗資料：FLT3ITD陽性組外周血白細胞數(shù)、骨髓白血病細胞比例高于FLT3ITD陰性組，均有統(tǒng)計學差異(P<0.01)(表1)。表1 AML患者FLT3ITD陽性者的臨床特點

　　2.3 FLT3ITD陽性AML患者的療效 采用DA(柔紅霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)方案治療;M3維甲酸;13例FLT3ITD陽性AML患者6例獲得CR(46.2%)，47例FLT3ITD陰性AML患者34例獲得CR(72.3%)，二者相比差異有顯著性(P<0.05)。

　　3 討 論

　　FLT3ITD突變是近年來AML中常見的突變類型之一。正常情況下，酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸激酶拮抗調節(jié)維持平衡的。如發(fā)生基因突變，將導致酪氨酸激酶持續(xù)活化，進而阻斷對細胞的分化、增殖和凋亡調節(jié)功能，與腫瘤發(fā)生有密切關系。有研究表明[67]，約有19.2%～32.0%的AML患者存在有FLT3ITD突變，在成人新發(fā)AML的陽性率22.9%，在老年AML的陽性率為31.4%，在FAB亞型中，F(xiàn)LT3/ITD突變在M3的陽性率高，M5次之，M2、M6的陽性率較低。我們檢測的結果顯示，在AML中FLT3ITD突變陽性率為21.67%，其中M3高，M5次之。說明FLT3ITD突變在AML患者的疾病發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，也提示FLT3ITD對于M3可能是一個預后不良的指標。

　　從臨床資料分析，F(xiàn)LT3ITD有它獨特的臨床表現(xiàn)，男女無統(tǒng)計學意義;老年AML患者FLT3ITD突變陽性率高于非老年，二者有顯著性差異，提示FLT3ITD突變可能與年齡有關，與老年AML的發(fā)生及預后存在密切關系，這與國內外報道相似[78]。我們的結果還顯示，F(xiàn)LT3ITD突變陽性者具有外周血白細胞數(shù)高、骨髓白血病細胞比例多的臨床特點，這與YANADA等[9]報道相似。我們的結果顯示，F(xiàn)LT3ITD陽性AML患者CR率較FLT3ITD陰性AML患者低，二者有顯著性差異。一方面說明FLT3ITD陽性AML患者對化療不敏感，有抗藥性，這與BANG等[10]報道一致，另一方面說明FLT3ITD陽性AML患者預后差。有作者對FLT3ITD重復序列的長度與預后的關系進行了研究，認為較長的重復序列與不良預后相關[11]，我們的結果顯示，F(xiàn)LT3ITD陽性AML患者CR率較FLT3ITD陰性AML患者低,二者有顯著性差異，F(xiàn)LT3ITD陽性AML患者外周血白細胞數(shù)、骨髓白血病細胞比例高于FLT3ITD陰性AML患者，這兩個指標均提示預后差，說明FLT3ITD基因突變可作為預測AML預后的一個指標。