KLF4、KLF6在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

　　作者：許越平,李勇,范立僑,趙群,王力利　　作者單位：河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011

　　【摘要】目的探討KLF4、KLF6在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系及意義。方法RTPCR技術(shù)檢測(cè)36例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜內(nèi)KLF4、KLF6的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果 胃癌組織中KLF4、KLF6的表達(dá)明顯低于正常組織(P<0.05);胃癌組織中KLF4的表達(dá)在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05); KLF6的表達(dá)隨分化程度的增加，TNM分期的增加而顯著降低(P<0.05)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 KLF4、KLF6在胃癌組織中低表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)。
　　【關(guān)鍵詞】 胃腫瘤;KLF4;KLF6;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)
　　Kruppe樣因子4(KLF4)是KLF家族C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在胃腸道中呈現(xiàn)高度表達(dá)。人KLF4基因定位于染色體9q31，編碼一個(gè)由470個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。有研究顯示，KLF4在結(jié)腸癌〔1〕、食管癌〔2〕組織中明顯低表達(dá)。KLF6基因定位于人類染色體10p15，有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。有報(bào)道KLF6與腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)行為有關(guān)〔3〕。但迄今關(guān)于KLF4、KLF6在胃癌中的表達(dá)情況尚無報(bào)道。本研究采用RTPCR方法檢測(cè)胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中KLF4、KLF6的表達(dá)，及其與腫瘤臨床病理學(xué)行為的關(guān)系，并對(duì)二者在胃癌中的意義進(jìn)行了探討。
　　1 材料與方法
　　1.1 研究對(duì)象

　　河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2007年1～7月手術(shù)切除胃癌標(biāo)本36例，所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后蘇木素伊紅(HE)染色病理證實(shí)，臨床資料完整，按全國胃癌診療規(guī)范統(tǒng)計(jì)分析臨床資料并行TNM分期，術(shù)前均未進(jìn)行治療。其中男32例，女4例;年齡22～80歲，中位年齡59歲;腫瘤切除后立即無菌條件下取癌組織、癌旁組織(距癌邊緣2 cm)及正常組織(距癌腫邊緣5 cm以上)約1.0×0.5×0.5 cm3，-80℃保存?zhèn)錂z。
　　1.2 RTPCR法測(cè)定KLF4、KLF6 mRNA表達(dá)

　　Trizol 和GoTaq綠色體系購自美國Promega公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司;KLF4、KLF6及內(nèi)參照3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的RTPCR特異引物序列均由上海生物工程有限公司提供。組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后PCR擴(kuò)增。引物序列如下：KLF4上游：5′CCATAATTCCTGCCCGAT3′;下游：5′CCAAGCTTCCAAAAGCCTCTTCATGTG3′;KLF6上游5′CGAGCCCTGCTATGTTTC3′;下游:5′ CATCGCCATTTCCCTTGT3′;GAPDH上游：5′ACAGTCCATGCCATCACTGCC3′;下游：5′GCCTGCTTCACCACCTTCTTG3′。反應(yīng)體系：GoTaq綠色體系12.5 μl;上、下游引物各2.0 μl;RNA模板2.0 μl;DEPC水6.5 μl。KLF4、KLF6 PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min、94℃變性30 s、退火30 s、70℃延伸1 min、共35個(gè)循環(huán),后72℃延伸10 min;KLF4退火溫度58℃，KLF6退火溫度52℃。取8 μl PCR產(chǎn)物置于1.6%瓊脂糖凝膠中，80 V電壓電泳30 min，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶掃描，以GAPDH作為內(nèi)參照物。
　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);三組以上組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，相關(guān)分析采用Person法。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 KLF4、KLF6 mRNA在各組織中的表達(dá)情況

　　胃癌組織中KLF4 mRNA的表達(dá)明顯低于正常組織(P<0.05)，癌旁組織和正常組織表達(dá)無顯著性差異(P>0.05);KLF6 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織(P<0.05);且癌旁組織中的表達(dá)也明顯低于正常組織(P<0.05)。見表1，圖1、2。M:Marker;T：胃癌組織;P：癌旁組織;N：正常組織圖1 KLF4、KLF6 mRNA在胃癌組織、癌旁組織和正常組中的表達(dá)表1 胃癌組織、癌旁、正常組織中 KLF4和KLF6 mRNA的表達(dá)表2 KLF4和KLF6 mRNA的表達(dá)與胃癌　　臨床病理特征的關(guān)系
　　2.2 KLF4、KLF6 mRNA的表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)行為的關(guān)系

　　胃癌組織中KLF4 mRNA的表達(dá)在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05);但其表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、Borrmann分型、分化程度、浸潤(rùn)深度，臨床分期均無關(guān)(P>0.05)。胃癌組織中KLF6 mRNA表達(dá)淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01);高分化程度組明顯高于中低分化程度組(P<0.05);臨床分期中Ⅰ、Ⅱ期明顯高于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05);其表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、Borrmann分型、浸潤(rùn)深度均無關(guān)(P>0.05)。見表2。
　　3 討 論
　　KLF4主要表達(dá)在胃腸道增殖較慢、趨向分化的上皮細(xì)胞中。Yang等發(fā)現(xiàn)8例結(jié)腸癌組織中2例存在KLF4基因雜合型缺失，2例存在過甲基化，而6個(gè)細(xì)胞系中有5個(gè)存在KLF4基因雜合型缺失，2個(gè)存在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變〔1〕。Wei等研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中KLF4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞過甲基化密切相關(guān)〔4〕。 本實(shí)驗(yàn)研究了KLF4分別在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中的表達(dá)，結(jié)果顯示：KLF4 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);關(guān)于其抑癌機(jī)制的研究Noti等〔5〕發(fā)現(xiàn)KLF4能夠招募組蛋白去乙?；傅紺D11d啟動(dòng)子區(qū)，從而抑制該基因的表達(dá)，提示KLF4可能通過染色質(zhì)重塑來抑制基因表達(dá)。但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。
　　KLF6是普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，通過與啟動(dòng)子GC盒結(jié)合激活下游基因的表達(dá)。KLF6的功能主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)抑制，通過P21蛋白的表達(dá)來發(fā)揮作用〔6〕。本研究結(jié)果表明KLF6在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，并且癌旁組織中的表達(dá)亦明顯低于正常組織;其表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。潘修成〔7〕等研究表明原發(fā)性肝癌中KLF6基因突變可能不是KLF6基因失活的主要原因，上調(diào)P21WAF1表達(dá)是KLF6基因抑制肝癌細(xì)胞增殖的主要途徑。馮潔〔8〕等研究表明KLF6、SP1蛋白在肝癌組織表達(dá)率高于癌旁肝硬化組織，正常組織中全部呈陰性表達(dá);癌組織中KLF6的高表達(dá)可能是在癌癥形成過程中被激活而發(fā)生的代償作用。這與Cho〔9〕等關(guān)于KLF6在結(jié)腸癌中的報(bào)道一致。
　　總之，KLF4、KLF6是與胃癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的抑癌基因。其具體抑癌的靶點(diǎn)目前研究尚無定論，需要進(jìn)行體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)以明確其抑癌作用的具體靶位，為胃癌分子生物治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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