流式細(xì)胞胞儀的分析及分選原理

         流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、光學(xué)與信號轉(zhuǎn)換測試系統(tǒng)和數(shù)字信號處理及放大的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)三大基本結(jié)構(gòu)組成。在對細(xì)胞懸液中的單個(gè)細(xì)胞或其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行多參數(shù)快速自動分析過程中，每秒鐘能測量數(shù)千個(gè)至數(shù)萬個(gè)細(xì)胞，能在分析過程中按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求對特定細(xì)胞進(jìn)行分析，帶細(xì)胞分選系統(tǒng)的流式細(xì)胞儀還可按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求分選出具相同特征的同類型細(xì)胞，用于培養(yǎng)或進(jìn)一步研究。

         一、工作原理 流式細(xì)胞儀的工作原理借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)，將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光，使其具有了更好的單色性與激發(fā)效率，同時(shí)利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，提高了檢測的靈敏度和特異性，并將固定的標(biāo) 本臺改為流動的單細(xì)胞懸液，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號的數(shù)據(jù)處理分析，提高了檢測速度與統(tǒng)計(jì)分析的精確性能。能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞上獲取多種參數(shù)資料。

         (一)基本組成結(jié)構(gòu)
         1．液流系統(tǒng) 
         由樣本和鞘液組成。待測細(xì)胞被制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，經(jīng)熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體染色后置入樣品管中，在清潔氣體壓力下進(jìn)入流動室形成樣本流；鞘液是輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液，其主要的作用是包裹在樣本流的周圍，使其保持處于噴嘴中心位置以保證檢測精確性，同時(shí)又防止樣本流中細(xì)胞靠近噴孔壁而堵塞噴孔。細(xì)胞懸液進(jìn)入鞘液中的孔徑通常 為 50～300μm孔徑。

         2．光學(xué)系統(tǒng) 
         由激光光源、分光鏡、光束成形器、透鏡組和光電倍增管組成。

         (1)激光光源：現(xiàn)代流式細(xì)胞儀采用的多為氣冷式氬離子激光器；

         (2)分色反光鏡：作用是反射較長波長的光，通過較短波長的光。

         (3)光束成形器：由兩個(gè)十字交叉放置的圓柱形透鏡組成，作用是將激 光器發(fā)射的激光束聚焦成高 15μm，寬 57 μm的橢圓光斑。

         (4)透鏡組：有三個(gè)透鏡，作用是將激光和熒光變成平行光，同時(shí)除去離散的室內(nèi)光。

         (5)濾片：長通濾片一允許長于設(shè)定波長的光通過；短通濾片一允許短于設(shè)定波長的光通過；帶通濾片一允許一定帶寬的波長通過，其他波長的光不能通過，有 525 nmBP，575 nmBP，620 nmBP，675 nmBP 4 個(gè)。

         (6)光電倍增管(pholomultiplier tube，PMT)：由 FS，SS，F(xiàn)Ll，F(xiàn)L2， FL3，F(xiàn)IA 組成，主要作用是檢測熒光和散射光，同時(shí)將光學(xué)信號轉(zhuǎn)換成電脈沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號。當(dāng)調(diào)整 PMT 電壓，脈沖信號也發(fā)生改變。

         3．?dāng)?shù)據(jù)處理系統(tǒng) 主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成。能對實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的存儲、顯示和分析更加智能化和自動化，是流式細(xì)胞儀組成部件中的重要環(huán)節(jié)。

         (二)基本工作原理
         按檢測需要標(biāo)記了特異性熒光染料的單細(xì)胞懸液和鞘液，分別經(jīng)硅化管進(jìn)入流動室，形成鞘液包裹細(xì)胞懸液的穩(wěn)態(tài)單細(xì)胞液柱，該液柱以穩(wěn)定的層流形式通過噴嘴高速射下，液柱與水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，單個(gè)細(xì)胞上標(biāo)記的熒光染料在通過激光光斑時(shí)被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光，同時(shí)，由于混合細(xì)胞群中細(xì)胞大小和胞內(nèi)顆粒的多少會被激發(fā)而產(chǎn)生不同的散射光。在入射光束與液柱垂直的方向有熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)，用于收集熒光信號和側(cè)向散射光信號，前向散射光感受器在前向小角探測接受前向光信號。被接收的光電信號被光電倍增管轉(zhuǎn)換成電壓脈沖和積分脈沖，使信號放大，該信號進(jìn)入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，儲存，分析，處理，按不同的檢測設(shè)計(jì)采用相應(yīng)軟件程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行綜合分析，并以圖像和數(shù)據(jù)顯示于熒光屏上，包括了單參數(shù)和二維或三維圖像資料，陽性細(xì)胞百分率，x±s，斜率，峰值，峰面積等多參數(shù)資料。一臺好的流式細(xì)胞儀每秒可測量 15 000 個(gè)細(xì)胞，測定 1 000 個(gè)熒光染料分子的粒子，這是目前其他儀器尚無法做到的。