酸性復(fù)灌液對缺血再灌注心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的影響

　　心肌缺血再灌注(I/R)期間導(dǎo)致過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS),并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡途徑引起細胞凋亡而導(dǎo)致心肌損傷川.缺血后處理可通過調(diào)控ERS反應(yīng)程度,抑制I/R誘導(dǎo)的過度ERS,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號介導(dǎo)的細胞凋亡而發(fā)揮心肌保護作用,而I/R初予以短暫的梯度酸性液復(fù)灌可產(chǎn)生與缺血后處理相似的心肌保護效應(yīng).我們采用Langendorff離體灌注模型,建立心肌I/R損傷動物模型,通過對ERS分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的研究,探討酸性梯度復(fù)灌液的心肌保護作用機制.
　　材料與方法 　　
　　1.材料:健康SD大鼠由青島市藥檢所動物中心提供,肌鈣蛋白I(cTn功試劑盒購自RD公司,原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)凋亡試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購自TaKaRa公司,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒為武漢博士德產(chǎn)品,通用型免疫組織化學(xué)二抗試劑盒購自美國Zymed公司.
　　2實驗分組:健康SD大鼠24只,雌雄不拘,體質(zhì)量200一400g,隨機分為3組(n=8):正常對照組(C),常規(guī)灌注pH7.4HEPES-KH液180min;缺血/再灌組(I/R),灌流20min后缺血60min,恢復(fù)灌注pH7.4HEPES-KH液100min;酸性灌注組(E),灌流20min后缺血60min,先用pH6.8HEPES-KH液灌注5min,然后換成pH7.1HEPES-KH液灌注5min,后以pH7.4HEPES-KH液灌注90min}HEPES-KH緩沖液成分(mmol/L);NaCl118.5,KCl4.7,CaClz1.8,MgS041.2,HEPES20.0,KHZP041.2,Glucose11.1.pH值根據(jù)應(yīng)用情況用SNHCL或SNNaOH調(diào)整為7.4,7.1,6.8.使用時新鮮配制,經(jīng)0.45Nm濾器過濾,灌流液以O(shè)Z持續(xù)平衡并維持在37℃.
　　3.標(biāo)本采集:實驗結(jié)束后,取大鼠左心室前壁同一部位心肌組織,用于心肌細胞凋亡檢測及免疫組織化學(xué)分析;其余左心室心肌組織放于凍存管中,液氮速凍后一80℃冰箱保存.
　　4.cTnl濃度測定:灌流結(jié)束時取冠脈流出液10ml,采用免疫雙抗體夾心法檢測cTnI濃度,檢測范圍為0一30p,群L,分析靈敏度為0.O1p.
　　5.大鼠心肌細胞凋亡測定:采用TUNEL法,按試劑盒說明進行心肌細胞凋亡的原位檢測.光鏡下正常心肌細胞核呈藍綠色,凋亡細胞核呈深淺不一的棕褐色.每張切片于凋亡細胞分布區(qū)域各取10個高倍視野,計算出平均每L00個細胞中的凋亡細胞數(shù),并以百分?jǐn)?shù)(%)表示凋亡指數(shù)(AI);AI(%)=單視野凋亡陽性細胞數(shù)/單視野總細胞計數(shù)x.
　　6.RT-PCR檢測大鼠心肌組織GRP78的表達:取大鼠左心室心肌,加人胰酶消化按常規(guī)程序獲取心肌細胞,裂解細胞.用Trizol提取總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進行PCR擴增.GRP78引物序列為:上游5'-GACATCAAGTTCT'I'GCCGTT-3',下游5'-CT-CATAACATTTAGGCCAGC-3’,擴增產(chǎn)物260by一肌動蛋白((3-actin)引物序列為:上游5'-TGGCATC-CACGAGACCACCTTCA-3',下游5'-GACTGCTGT-CACCTTCACCGTTCC-3',擴增產(chǎn)物496by.擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析,以平均灰度值表示表達量.
　　7.GRP78蛋白表達:應(yīng)用Westernblot方法檢測.各組實驗結(jié)束后,取左心室心肌,加人胰酶消化按常規(guī)程序獲取心肌細胞,加人十二烷基硫酸鈉(SDS)加樣緩沖液裂解細胞,經(jīng)水浴、離心,收集上清,采用二咬琳甲酸(RCA)法進行蛋白定量.每一樣品(50},g)與等體積的2x上樣緩沖液混勻,經(jīng)電泳分離,轉(zhuǎn)膜,封閉后,加人GRP78(1:1000)多克隆抗體孵育過夜,然后加人第二抗體室溫孵育,經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色發(fā)光,放射自顯影檢測,分析測定GRP78蛋自條帶掃描灰度變化.
　　8.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗.
　　

　　結(jié)果
　　1.各組大鼠心肌流出液cTnl檢測結(jié)果:與C組(1.3士0.4)g/L比較,I/R組(12.5士3.2)L和E組(6.711.6)ng/LcTnI濃度均增高(P<0.01)0與I/R組比較,E組cTn工濃度均降低(P<0.01).
　　2.大鼠心肌細胞凋亡結(jié)果:C組心肌細胞凋亡較少,AI為(3.5士1.1)%,I/R組[(27.9士5.3)%較C組明顯增力II(P<0.01),而E組[(18.0士3.9)%〕較I/R組明顯降低(P<0.01).
　　3.RT-PCR測定大鼠心肌GRP78表達結(jié)果(圖1);GRP78表達水平C組(0.43士0.04)明顯低于I/R組(0.95士0.07)和E組(0.62士0.06,P<0.0l),而I/R組明顯高于E組(P<0.01).
　　4.大鼠心肌GRP78蛋白檢測結(jié)果(圖2):Gi}p7s表達水平C組(384士75)明顯低于I/R組(769士132)和E組(542士98)(P<0.01),而I/R組明顯高于E組(P<0.O1).
　　討論
　　我們在離體心臟進行研究顯示,酸性復(fù)灌液具有心肌保護作用,其機制未完全闡明.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的細胞器,I/R過程中的多種刺激因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)聚集以及鈣穩(wěn)態(tài)失衡等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙,觸發(fā)ERS適度ERS導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)促生存的蛋白分子表達增加,從而減輕心肌損傷;但若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷太過嚴(yán)重,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時恢復(fù),ERS將誘導(dǎo)促凋亡因子活化,導(dǎo)致細胞凋亡〔78〕.
　　GRF'78是ERS的標(biāo)志性分子伴侶蛋白,ERS時,CRP78與聚集的未折疊蛋自結(jié)合,促進其折疊,GRP78過表達可增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊蛋白的能力本實驗結(jié)果顯示,缺血再灌注與酸性復(fù)灌液復(fù)灌均使GRF'78表達調(diào),而酸性復(fù)灌液復(fù)灌可降低GRP78表達升高的幅度,誘導(dǎo)GRP78表達輕度增加,表明酸性復(fù)灌液復(fù)灌產(chǎn)生的心肌保護作用與ERS有關(guān),且可減輕I/R導(dǎo)致的過度ERS.然而,低pH液復(fù)灌如何通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)ERS目前仍然不清楚.
　　本研究結(jié)果表明,心肌I/R初期短暫低pH液梯度復(fù)灌產(chǎn)生的心肌保護作用通過調(diào)節(jié)GRP78表達,抑制I/R導(dǎo)致的過度ERS,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡而產(chǎn)生心肌保護效果.
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