微小RNA-143抑制人腎癌細胞株A498增殖及其對凋亡的影響

　　近期研究結果顯示,一類具有調控功能的內源性非編碼RNA,其大小長20一25個核昔酸,簡稱微小RNA(miRNA),miRNA通過與其靶mRNA的端非翻譯區(qū)結合實現(xiàn)靶mRN;}降解或翻譯抑制的作用,從而實現(xiàn)轉錄后水平基因表達調控的作用,廣泛參與多種生物學進程如增殖、分化、凋亡等廠’目前關于miR-143在腎癌中的表達及作用的研究報道尚少_我們通過化學合成miR-143模擬物,觀察其對腎癌細胞株X498增殖及凋亡的影響.
　　材料與方法 　　
　　1.材料:人腎癌細胞株A498購自中國科學院細胞生物學研究所,Opti-MEMI轉染用無血清培養(yǎng)基購自Cil>c<,公司,miR-143mimic及轉染指示劑購自廣州銳博科技有限公司,Lipofectamine 2000(簡稱Lipo2000)購白美國Invitrogen公司,細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)試劑盒、胎牛血清(FBS),RPMI1640培養(yǎng)基購自碧云天生物公司,膜聯(lián)蛋白`l一異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司.
　　2.細胞培養(yǎng)及轉染:A498細胞株采用含10%FBS,100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI164.培養(yǎng)液在37}C,501cCOZ條件下培養(yǎng)實驗時取對數(shù)生長期細胞,轉染前241;將細胞1:2傳代于6孔板中,以不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞生長至80}}e-90%左右時進行轉染.按照Lipofectamine2000使用說明轉染miR-143mimics及對照序列,實驗分為3組:miR-143mimics轉染組、陰性對照轉染組(I\C組)、空白對照組(Opti-MEMI無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的A498細胞)miR-143mimics和轉染對照序列用量為60nmol/L;同時轉染F.}M標記的陰性對照為60nmol.}L轉染24h后熒光顯微鏡(Olympus公司)下觀察并評估轉染效率,進行后續(xù)實驗.
　　3.CCK-8檢測細胞增殖活性:細胞轉染6h居,}6孔板消化,洗滌、離心、混勻后計數(shù)2x10個接種于96孔板中,每組細胞設6個復孔,另設6孔空白對照用于去除背景,繼續(xù)培養(yǎng)至24,48,72,96h,每孔加入IO閃CCK-8試劑,繼續(xù)孵育1h,酶標儀(Labsvstem公司)測定490nm處各孔吸光度(Aa9o)值,扣除背景后,作出細胞增殖曲線,實驗重復3次4..}nnexin`'-FITC細胞凋亡檢測:取對數(shù)生長期細胞,按方法2中分組進行轉染,每組設3個復孔,轉染48h后,消化收集細胞并用400目濾網過濾,制備濃度1x100/L單細胞懸液.磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,用200閃1x結合緩沖液將細胞重懸,取100},1細胞重懸液加入5N.,1Annexin}-FITC和5}l碘化丙錠(PI標記,避光室溫反應15min,再加人400}.ilx結合緩沖液,Ih內上流式細胞儀分析細胞凋L_率,結果取平均值.
　　

　　5.統(tǒng)計學方法:應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差(x1.s)表示,采用Student'st檢驗和方差分析,兩兩比較采用LSD法結果1.細胞轉染效率檢測:X498細胞轉染F_}11轉染指示劑對照序列24h后,熒光顯微鏡下觀察熒光分布,可見80%以上的細胞內有熒光分布,轉染效率達80%以上2.CCK-8檢測細胞增殖:從圖1結果叮見,轉染后24,48,72,96h與空白對照組比較,>yC組細胞增長未見抑制,而,niR-143mimics轉染組細胞增殖則明顯抑制,抑制效應在轉染48h后顯現(xiàn),并持續(xù)48h以上(P<0.O5).
　　3.流式細胞儀檢測轉染miR-143mimics后A498凋亡結果:miR-143mimics轉染組細胞凋亡率為(9.10士2.31)%,顯著高于NC組〔(4.23士1.52>%.與空白討照組}13.4311.61)%,組間差異有統(tǒng)計學意義{P<0.O5).
　　討論
　　目前已發(fā)現(xiàn)多種miR1}A與腫瘤關系密切,如miR-155,miR-200c,miRNA-518h等[?-3,部分小分子RNA可作為腫瘤診斷和預后的標志分子例如let-7,miR-16等,對確定治療方案有重要作用"1TI1R}'A可能通過調控多種分子通路參與腎癌的發(fā)生,如細胞增殖、凋亡逃逸、血管生成等?J.本研究通過化學合成miR-143mimics,并將其轉染至人腎癌細抱株A498中,檢測其對腎癌細胞增殖及凋亡的影咽,發(fā)現(xiàn)其具有抑制細胞增殖、誘導腎癌細胞凋亡的作用一提示小分子miR-143可能為腎癌的潛在治療靶點,其具體的分子機制尚有待進一步研究.
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