實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44v8在膀胱及尿路上皮癌中的表達(dá) A

摘要：目的探討CD44v8在膀胱及尿路上皮癌的臨床診斷價(jià)值。方法 收集實(shí)驗(yàn)組患者膀胱及尿路上皮癌患者75例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)從病理和臨床分期2個(gè)方面對(duì)CD44v8進(jìn)行定量分析。對(duì)照組20例患者為正常膀胱黏膜組織。

結(jié)果 CD44v8蛋白在對(duì)照組膀胱黏膜上皮無(wú)表達(dá)，拷貝數(shù)小于1×102拷貝／毫升。75例膀胱及尿路上皮癌患者陽(yáng)性表達(dá) 26例(34.7%)，CT值均小于35，基因拷貝數(shù)均大于1×104拷貝／毫升。陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤病理分級(jí)、腫瘤分期(TNM)相關(guān)，與腫瘤復(fù)發(fā)和數(shù)量無(wú)相關(guān)性。結(jié)論CD44v8可作為判斷膀胱及尿路上皮癌分級(jí)、分期的參考指標(biāo)，具有臨床診斷意義。 關(guān)鍵詞：上皮癌； 膀胱； 尿路； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR； CD44v8蛋白
The detection of the ex[x]pression of CD44v8 with RT-PCR in bladder and urothelial carcinoma'
LIU Xiaorong1 ,WANG Yongxiang2 ,ZHAO Limingz ,ZHAN Xiaodong2 ,LIU Xuejun2 ,REN Yulin2 ,11 Shaojun2
(1. Department o f Clinical Laboratory ;2. Department o f Urology,the Second People's Hospital of Gansu Province ,Lanzhou,Gansu 730000,Ch/na)
Abstract:ob[x]jective To explore the ex[x]pression of CD44v8 protein in human bladder and urothelial carcinoma,as well as the value in diagnosis of human bladder and urothelial carcinoma. Methods RT-PCR was used to analysis the ex[x]pression of CD44v8 protein in 75 patients with bladder and urothelial carcinoma in the pathological stage and clinical stage and 20 subjects of normal bladder mucosa were collected as control. Results CD44v8 protein was negative in all normal bladder and urothelial mucosa,the copy number was less than l X 102 copy/mL; 26 cases of bladder and urothelial carcinoma was positive,and the positive rate of CD44v8 was 34. 7% ,and Ct values were less than 35 and copy number was greater than lXl04 copy/mL. Positive rate was correlated with high pathological grades and TNM stages,but no significant difference was observed in recurrence of tumor. Conclusion CD44v8 could be useful indicator for the assessment of pathological grades and TNM stages of bladder and urothelial carcinoma.
Key words:carcinoma; bladder; urothelial carcinoma; RT-PCR; CD44v8 protein
侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤本質(zhì)的特征，其與很多因素相 關(guān)，目前對(duì)惡性腫瘤各種因子的研究已成為熱點(diǎn)[1]。CD44分 子通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、膠原蛋白、血管內(nèi)皮細(xì)胞 等黏附，致使腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力，在腫瘤的 發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CD44與多種腫囊的復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[2-4]。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)CD44v8蛋白在膀胱及尿路上皮細(xì)胞癌中的表達(dá)，探討CD44v8與膀胱尿路上皮細(xì)胞癌病理分級(jí)、 臨床分期、復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

l資料與方法

1.1-般資料75例膀胱尿路上皮細(xì)胞癌標(biāo)本選自2010年 1月至20014年6月該院泌尿外科手術(shù)切除且經(jīng)病理確診患者（實(shí)驗(yàn)組），男59例，女16例，年齡28～86歲，平均年齡57歲，根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)( UICC)制定的腫瘤分期(TNM)標(biāo)準(zhǔn)： Tis-a期14例，Tl期25例，T2期21例，T3期10例，T4期5舅；病理I級(jí)27例，Ⅱ級(jí)25例，Ⅲ級(jí)23例；初發(fā)組51例，復(fù)發(fā)組24例；單發(fā)組51例，多發(fā)組24例。20例對(duì)照組患者膀胱 尿路上皮細(xì)胞組織均取自經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù)，經(jīng)病理證實(shí) 為正常膀胱黏膜組織。

1.2儀器與試劑 API7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。核酸提取液B，逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq酶系，CD44v8 PCRMIX，CD44v8陽(yáng)性 質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品，均由北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3方法

(1) DNA提?。哼x取約50 mg膀胱黏膜組織轉(zhuǎn)移 至1.5 mL干凈離心管中，加1 mL生理鹽水混勻，研磨器研制成勻漿，12 000 r／min離心5 min，棄上清液，沉淀加50 μL核 酸提取液(DNA)，充分混勻，100℃處理10 min，12 000 r/m離 心5 min，取上清液4μL做PCR反應(yīng)。

(2) PCR擴(kuò)增：從試劑盒中取出CD44v8 PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻， 10000r/min離心10s。參考北京索奧生物醫(yī)藥科技試劑盒 說(shuō)明書(shū)提取膀胱尿路上皮癌患者總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 CD44v8引物序列上游為：5'-TGG ACT CCA GTC ATA GTA TAA CGC-3’；下游為：5'-GGT CCT GTC CTG TCC AAA.TC-37，測(cè)試反應(yīng)體系配置為：CD44v8PCR MIX 24μL，逆轉(zhuǎn)錄 酶4μL，Taq酶系2μL。向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加 入26μL反應(yīng)體系，向每管中加入處理后的樣品或CD44 v8陽(yáng) 性定量標(biāo)準(zhǔn)品（使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10、100、1 000倍，記為1×10 6、1×10 5、1×104拷貝／毫升）和陰性質(zhì)控品4μL，10000 r／min瞬時(shí)離心3s。將各反應(yīng)管放入定量PCR反 應(yīng)槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品及未知 標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體系30 μL，樣品名稱(chēng)，標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(lèi)(報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA)和循環(huán)條件：95℃ 30 s，然后95℃5s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4結(jié)果判讀

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：r=0. 99，陽(yáng)性CT≤35，基因拷貝數(shù)為1×104拷貝／毫升。

(2)各待測(cè)反應(yīng)管曲線(xiàn)圖：分別繪 制TNM分期CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線(xiàn)圖；WHO病理分級(jí)CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線(xiàn)圖；臨床分期CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線(xiàn)圖；腫瘤數(shù)量CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線(xiàn)圖，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料組間比較使用方差分析和t檢驗(yàn)，兩樣本率的比較應(yīng)用X2檢驗(yàn)。P

2結(jié) 果

2.1 CD44v8在2組患者中的表達(dá)結(jié)果比較CD44v8蛋白在 對(duì)照組正常膀胱及尿路上皮細(xì)胞中不表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)組膀胱及尿 路上皮癌的陽(yáng)性表達(dá)26例，陽(yáng)性率34.7%。 2.2 CD44v8與實(shí)驗(yàn)組膀胱尿路上皮癌TNM分期的關(guān)系 CD44v8蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨TNM分期增加而升高，Tis-a期3例(21.4%)，T1期7例(30.4%)，T2期8例(40．O%)，T3期5例(50．O%)，T4期3例(37.5%)，淺表性( Tis-a～Tl)與浸潤(rùn) 性(T2～T4)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 CD44v8與實(shí)驗(yàn)組膀胱尿路上皮癌病理分級(jí)的關(guān)系 CD44v8蛋白表達(dá)隨病理分級(jí)增加而升高，I級(jí)4例(14.8%)， Ⅱ級(jí)9例(36%)，Ⅲ級(jí)13例(56.5%)，高分化膀胱尿路上皮癌（I級(jí)）與低分化膀胱尿路上皮癌（Ⅱ、Ⅲ級(jí)）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。