孤獨癥早期胚胎發(fā)育過程中表觀遺傳調(diào)控失衡

報道指出GAD1基因是評價大腦興奮-抑制平衡的關(guān)鍵基因。研究人員利用孤獨癥患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）培養(yǎng)腦類器官，分析GAD1基因調(diào)控區(qū)的差異甲基化譜。這項研究使孤獨癥患者大腦中興奮-抑制失衡與早期發(fā)育中表觀基因調(diào)控的失衡聯(lián)系起來。

背 景 介 紹

DNA甲基化常見于胞嘧啶和CpG位點，是一種重要的表觀遺傳修飾的方式，可以在不改變DNA序列的情況下可逆地調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

研究表明，孤獨癥患者CpG位點的DNA甲基化模式與健康對照不同。在胎盤組織中也發(fā)現(xiàn)這種差異，提示在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中，表觀遺傳修飾可能參與影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)處理信息的關(guān)鍵是保持興奮（E）和抑制（I）的平衡。興奮—抑制失衡也是導(dǎo)致孤獨癥的病理機(jī)制之一。γ—氨基丁酸（GABA）是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在維持E/I的平衡中起到非常重要的作用。

GAD1是調(diào)節(jié)GABA水平的關(guān)鍵基因，它可以編碼催化GABA合成的谷氨酸脫羧酶異構(gòu)體，因此GAD1是評價E/I平衡的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

為了研究孤獨癥患者在胚胎發(fā)育過程中GAD 1甲基化模式的變化，研究人員利用來自孤獨癥患者和健康人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSCs)生成腦器官。用腦類器官對GAD1基因的已知調(diào)控靶區(qū)進(jìn)行靶向DNA甲基化分析。

一、腦類器官的培養(yǎng)階段

利用從全腦類器官中提取的DNA，研究人員進(jìn)行了亞硫酸氫鹽測序，以分析GAD1基因調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)。

二、孤獨癥患者腦組織中GAD1的DNA甲基化模式更加多樣化

本研究所用的腦類器官來自5名健康對照者和4名孤獨癥患者。研究人員通過亞硫酸鹽測序分析了轉(zhuǎn)錄起始位點下游約3400bp處GAD1基因調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)。

研究成果

對照組：研究人員在對照組中觀察到的甲基化特征。

在隨機(jī)挑選的克隆中，大多數(shù)(94.3%)的擴(kuò)增產(chǎn)物甲基化水平較高。在5個對照類器官中，僅檢測到1個甲基化<50%的擴(kuò)增子克隆。

孤獨癥組：研究人員觀察到，盡管絕大多數(shù)（90.3%）的克隆也顯示出高水平的甲基化，4個孤獨癥組的大腦器官中有3個被檢測到含有甲基化<50%的擴(kuò)增子克隆。

此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，孤獨癥組擴(kuò)增子的DNA甲基化譜的多樣性增加。為了進(jìn)一步分析兩組基因的甲基化狀態(tài)，研究人員對甲基化>50%的優(yōu)勢基因組進(jìn)行了差異分析。甲基化模式進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

由于甲基化差異不僅存在于個體之間，也存在于不同的組織器官之間，研究人員亞克隆目標(biāo)擴(kuò)增子，以單細(xì)胞分辨率鑒定GAD1的DNA甲基化模式，并觀察每組的共同點。

一、研究結(jié)果

孤獨癥組：11個克隆表現(xiàn)出獨特的甲基化模式（模式7-17）。

對照組：只有1個克隆具有獨特的甲基化模式（模式5）。

這表明，孤獨癥組中有很大一部分細(xì)胞具有獨特的甲基化模式，與對照組不同。

二、研究成果的分析

孤獨癥組中甲基化水平的高度變化和CpG相關(guān)變異的增加表明，調(diào)控DNA甲基化的成分在發(fā)育過程中可能被破壞。

以往的研究表明，作為表觀遺傳途徑的關(guān)鍵成分之一的雙加氧酶(Tet)mRNA在成人孤獨癥患者大腦中的表達(dá)明顯增加。此外，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）與GAD1在靶區(qū)上游區(qū)域的結(jié)合頻率增加。

DNMT可以維持DNA甲基化，TET家族酶可以介導(dǎo)活性的去甲基化過程。

因此，研究人員推測，這兩個關(guān)鍵的表觀遺傳成分在早期發(fā)育階段的破壞增加了孤獨癥患者甲基化模式的多樣性。

三、 GAD1靶區(qū)CpG位點的差異甲基化

為了進(jìn)一步比較DNA甲基化特征的多樣性，研究人員分析了擴(kuò)增子甲基化率＞50%的克隆中每個CpG位點的甲基化變異性。

一、研究成果

（1）孤獨癥組6個CpG位點的甲基化與對照組比較有差異，孤獨癥組CpG位點的整體變異性增加。

(2) 在孤獨癥組中，6個差異甲基化的CpG位點中有5個是低甲基化的。

（3）在6個CpG差異甲基化位點中，有3個位于CTCF結(jié)合位點。

二、研究成果的分析

在GAD1靶區(qū)，有一個CTCF的結(jié)合序列，CTCF是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，可以與增強(qiáng)子和啟動子相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。當(dāng)CTCF結(jié)合序列的DNA甲基化時，它可以通過阻止CTCF介導(dǎo)的多梳蛋白抑制復(fù)合物2的募集過程來激活GAD1的表達(dá)，導(dǎo)致GAD1轉(zhuǎn)錄增加和mRNA表達(dá)增加。

值得注意的是，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在孤獨癥患者中發(fā)現(xiàn)的6個差異甲基化CpG位點中，有3個位于CTCF結(jié)合位點，其余差異CpG位點也非常接近CTCF結(jié)合位點（上下100個堿基對以內(nèi)），提示孤獨癥患者CTCF結(jié)合位點容易發(fā)生差異甲基化。

雖然位于CTCF結(jié)合位點的三個分化的CpG位點是連續(xù)的，但位點28是高甲基化的，而位點29和30是低甲基化的。這是一個異常，因為相鄰的CpG位點通常應(yīng)該具有相同的甲基化狀態(tài)。

這表明雖然每個CpG位點的甲基化狀態(tài)對CTCF結(jié)合序列的影響尚不清楚，但這三個位點的差異甲基化表明了孤獨癥患者器官中轉(zhuǎn)錄因子CTCF的結(jié)合靶點，序列的概率會發(fā)生變化。

此外，結(jié)果顯示了CTCF結(jié)合序列中甲基化降低的總體趨勢。因為如上所述，在正常情況下，當(dāng)CTCF的結(jié)合序列發(fā)生甲基化時，DNA甲基化可以通過阻止CTCF介導(dǎo)的多梳蛋白抑制復(fù)合物2的募集過程來激活GAD1的表達(dá)，從而導(dǎo)致GAD1轉(zhuǎn)錄增加，mRNA表達(dá)增加。所以，CTCF甲基化的降低可以解釋在孤獨癥患者中觀察到的GAD1和GAD67的表達(dá)減少。

總結(jié)

1、小結(jié)

GABA能信號是維持神經(jīng)回路興奮抑制平衡的關(guān)鍵，神經(jīng)回路經(jīng)常發(fā)生在精神疾病如孤獨癥中。GAD1是調(diào)節(jié)GABA水平的關(guān)鍵基因，是評估興奮-抑制平衡的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

研究人員重點研究了GAD1的一個功能相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)孤獨癥組大腦類器官靶區(qū)的DNA甲基化譜異常。

此外，通過分析孤獨癥患者和正常個體的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)孤獨癥患者腦類器官中的GAD1甲基化譜失去了規(guī)律性。

2.討論

不同類型的細(xì)胞有不同的DNA甲基化模式，大腦也不例外。不同類型的神經(jīng)元亞群的基因也有特定的甲基化特征，如興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元之間就存在特定的甲基化差異。

此前對孤獨癥患者腦類器官的研究也表明，這兩類神經(jīng)元存在特異性甲基化紊亂，與孤獨癥的進(jìn)展有關(guān)。

鑒GAD1可以調(diào)節(jié)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的水平，研究人員推斷GAD1參與了特異細(xì)胞形成特有甲基化模式的過程。

因此，未來的研究方向可以通過分析特定類型細(xì)胞的甲基化模式，進(jìn)一步了解在孤獨癥患者神經(jīng)發(fā)育過程中，DNA甲基化異常和靶向表觀遺傳修飾異常對孤獨癥患者神經(jīng)功能的影響。

本研究證明GAD1基因與孤獨癥相關(guān)，在孤獨癥患者胚胎發(fā)育階段，GAD1受到表觀遺傳學(xué)調(diào)控。這項研究確定了6個潛在的GABA能生物標(biāo)記物，其中3個位于功能相關(guān)的CTCF結(jié)合序列中。這些發(fā)現(xiàn)可以將被破壞的表觀遺傳修飾與孤獨癥患者大腦中的興奮-抑制失衡聯(lián)系起來。