發(fā)現(xiàn)患者和腫瘤類型間共有新抗原的HLA-新表位

精腫瘤免疫療法的廣泛應(yīng)用受到患者或腫瘤類型中常見的有效新表位數(shù)量的限制。為了擴(kuò)大已知的共享新抗原-HLA復(fù)合體庫，開發(fā)了一個(gè)高通量平臺(tái)，將體外多肽-HLA結(jié)合分析與表達(dá)單個(gè)HLA等位基因的工程細(xì)胞模型相結(jié)合，并結(jié)合含有47種常見腫瘤新抗原的串聯(lián)轉(zhuǎn)基因。從24000多個(gè)可能的新表位-HLA組合中，生化和計(jì)算評(píng)估產(chǎn)生了844個(gè)獨(dú)特的候選，其中86個(gè)是在對(duì)工程的單等位基因細(xì)胞系進(jìn)行免疫沉淀質(zhì)譜分析后得到驗(yàn)證的。為了評(píng)估免疫原性的可能性，鑒定了識(shí)別特定新表位-HLA對(duì)的TCR，并在引入人T細(xì)胞后引發(fā)反應(yīng)。這些細(xì)胞系統(tǒng)和關(guān)于治療相關(guān)的新表位在其HLA背景下的數(shù)據(jù)將幫助研究人員研究抗原加工以及新表位靶向治療。

這里提出了一個(gè)可擴(kuò)展的新表位-HLA對(duì)發(fā)現(xiàn)的pipeline。選擇了47個(gè)癌癥突變和15個(gè)流行的HLA等位基因來定義新表位，進(jìn)而確定假定的臨床靶點(diǎn)。采用高通量的HLA結(jié)合分析和NetMHCpan4.0通過實(shí)驗(yàn)和計(jì)算確定新表位-HLA的組合，以供后續(xù)研究。用這兩種方法觀察到的新表位-HLA對(duì)，用非靶向和靶向質(zhì)譜(MS)對(duì)經(jīng)修飾的HLA單等位基因細(xì)胞系進(jìn)行呈遞分析，得到86個(gè)新表位-HLA對(duì)。為了評(píng)估這些靶點(diǎn)的治療潛力，使用了通過TCR抗原多重鑒定(MIRA)鑒定發(fā)現(xiàn)的TCR，并證明了突變選擇性T細(xì)胞靶向表達(dá)這些新表位的細(xì)胞。

共有腫瘤新抗原的臨床基因組學(xué)分析

為了建立新表位-HLA發(fā)現(xiàn)的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)pipeline，首先在腫瘤和正常組織樣本的測序數(shù)據(jù)中確定了癌癥類型中常見的復(fù)發(fā)點(diǎn)突變。這得到了36個(gè)共有的腫瘤新抗原。接下來，挖掘等位基因頻率網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(AFND)和癌癥基因組圖譜(TCGA)來分類常見的單倍型，縮小到TCGA中攜帶者頻率至少為10%，AFND中等位基因頻率至少為5%的單倍型。這一分析得到了16個(gè)HLA等位基因，這些等位基因與36個(gè)選定的新抗原相結(jié)合，為平臺(tái)的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

新表位-HLA的高通量TR-FRET分析

為研究候選腫瘤新抗原和選定HLA等位基因之間的所有潛在新表位，建立了一種基于肽介導(dǎo)的條件性HLA復(fù)合體穩(wěn)定的高通量時(shí)間分辨熒光能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)分析方法。新抗原靶點(diǎn)集由上述36個(gè)共享的腫瘤新抗原和另外11個(gè)腫瘤抗原組成。另外，16個(gè)優(yōu)先考慮的HLA中有15個(gè)在條件HLA復(fù)合體形式下是可行的。總而言之，這使得在消除重疊的腫瘤新表位以及由于合成挑戰(zhàn)而產(chǎn)生的一個(gè)等位基因后，能夠表征24149個(gè)新表位-HLA復(fù)合物。

預(yù)先負(fù)載紫外線(UV)可裂解多肽的條件性HLA復(fù)合體與感興趣的新表位以100倍摩爾過量孵育，并在UV下暴露25min。這個(gè)反應(yīng)導(dǎo)致條件配體斷裂和肽從穩(wěn)定的高親和力的‘結(jié)合劑’轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定的結(jié)合劑，它從HLA的溝槽中解離。在有結(jié)合的新表位存在的情況下，肽交換將穩(wěn)定HLA復(fù)合體，而缺乏結(jié)合會(huì)導(dǎo)致復(fù)合體解離。通過與anti-β2M抗體偶聯(lián)的TR-FRET供體(Eu)和與鏈霉親和素偶聯(lián)的TR-FRET受體的熒光來監(jiān)測絡(luò)合物的穩(wěn)定性，鏈霉親和素與HLAα鏈上的生物素標(biāo)記結(jié)合，其中只有當(dāng)復(fù)合體保持完整時(shí)才能觀察到TR-FRET信號(hào)?；谙鄬?duì)熒光單位(RFU)的比率對(duì)TR-FRET信號(hào)進(jìn)行量化，并對(duì)信號(hào)進(jìn)行雙重歸一化以生成穩(wěn)健的Z分?jǐn)?shù)(RZ-Score)。任何新表位-HLA與RZ-Score≥5的結(jié)合都被認(rèn)為是“穩(wěn)定的結(jié)合”，這是基于陽性對(duì)照CMV-peptide/HLA-A*02:01復(fù)合物的先前評(píng)估的保守措施。Z-Score≥5捕獲了90%的陽性對(duì)照結(jié)合事件，而沒有識(shí)別假陽性結(jié)合蛋白。

為了更好地理解TR-FRET結(jié)果與計(jì)算預(yù)測方法的比較，使用了NetMHCpan4.0?？紤]了NetMHC結(jié)合親和力(BA) %Rank相對(duì)于TR-FRET結(jié)果和洗脫配體(EL)%Rank來確定是否預(yù)測到新的表位出現(xiàn)(%Rank≤2)。KRAS G12V與A*03:01結(jié)合的代表性數(shù)據(jù)顯示，先前描述的兩個(gè)新表位VVGAVGVGK和VVVGAVGVGK，作為兩種方法的結(jié)合體(圖1d)。對(duì)新抗原-HLA組合的進(jìn)一步檢查顯示，TR-FRET和NetMHC結(jié)果之間有可變的一致性。用C*08:02對(duì)KRAS G12D多肽的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，已知的新表位(GADGVGKSAL)是這兩種方法的結(jié)合體。

當(dāng)測量所有潛在的新表位-HLA復(fù)合體的百分比時(shí)，TR-FRET通常比NetMHC識(shí)別出更穩(wěn)定的結(jié)合。當(dāng)對(duì)結(jié)合體進(jìn)行分類時(shí)，NetMHC預(yù)測和TR-FRET之間的一致性一般不到30%，而只有在非結(jié)合體的情況下才發(fā)現(xiàn)更強(qiáng)的一致性。為了進(jìn)一步比較，繪制了所有候選新表位-HLA的TR-FRET RZ-Score和NetMHC %Rank，表明兩種方法都有0.63%的新表位-HLA對(duì)是可能的結(jié)合體。不同的方法確定了新表位-HLA的額外結(jié)合事件的相似百分比，表明每一種方法都有可能發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的結(jié)合組合。這些發(fā)現(xiàn)突顯了高通量TR-FRET分析相對(duì)于計(jì)算預(yù)測識(shí)別的擴(kuò)展和互補(bǔ)的新表位-HLA對(duì)的能力，并表明為了全面發(fā)現(xiàn)新表位，需要兩種方法的共同部署。

構(gòu)建共表達(dá)47種新抗原的單等位基因細(xì)胞

盡管在體外觀察到多肽-HLA的穩(wěn)定性或相互作用的計(jì)算預(yù)測，突變蛋白的表達(dá)和加工可能不會(huì)導(dǎo)致在細(xì)胞環(huán)境中呈現(xiàn)新的表位。因此，候選新表位的驗(yàn)證通常需要通過HLA免疫沉淀(HLA-IP)和MS與表面結(jié)合的HLA直接物理關(guān)聯(lián)的證據(jù)。這一過程通過使用工程化的“HLA單等位基因”細(xì)胞系得到加強(qiáng)，盡管這些細(xì)胞系在很大程度上依賴于內(nèi)源性突變蛋白的表達(dá)或相對(duì)較少的突變轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，從而限制了通量。

在單個(gè)HLA-null細(xì)胞系中共表達(dá)所有47個(gè)候選新抗原序列(以突變位置為中心的~25個(gè)氨基酸片段)將提高單等位細(xì)胞系生成的通量，并隨后通過靶向MS驗(yàn)證TR-FRET/NetMHC鑒定的新表位-HLA對(duì)。為此，選擇了缺乏HLA-A和HLA-B的HMy2.C1R(C1R)淋巴母細(xì)胞系。為了產(chǎn)生一個(gè)完整的C1R-HLAnull細(xì)胞系，用CRISPR-Cas9破壞了HLA-C等位基因(HLA-C*04:01)，并用FACS富集HLA缺失群體。

局部氨基酸序列背景可能會(huì)影響抗原的處理。因此，設(shè)計(jì)了獨(dú)特的C1R-HLAnull以穩(wěn)定表達(dá)所有47種優(yōu)先考慮的新抗原的串聯(lián)，這些新抗原是否被短的而靈活的氨基酸接頭分離。隨后，通過穩(wěn)定的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)有接頭和無接頭新抗原表達(dá)的C1R-HLAnull細(xì)胞系，將15個(gè)HLA等位基因作為單個(gè)轉(zhuǎn)基因引入，產(chǎn)生了30個(gè)細(xì)胞群。為了驗(yàn)證多抗原盒的功能，有接頭和無接頭新抗原構(gòu)建體包含一組相同的七個(gè)已知的HLA-A*02:01呈遞表位。HLA-IP隨后的靶向MS分析證實(shí)，在有接頭和非接頭的HLA-A*02:01工程細(xì)胞中都存在兩個(gè)對(duì)照肽和先前描述的TP53 R175H新表位。

檢測工程化單等位基因細(xì)胞新表位

靶向和非靶向MS均應(yīng)用于單等位細(xì)胞系的新表位發(fā)現(xiàn)。非靶向MS分析能夠無偏見地從整個(gè)免疫肽組中識(shí)別多肽，而靶向分析有助于檢測每個(gè)細(xì)胞拷貝數(shù)較低的多肽，但僅限于TR-FRET/NetMHC分析中的優(yōu)先序列。

用半自動(dòng)工作流程進(jìn)行非靶向MS分析，從每個(gè)細(xì)胞群中鑒定出218-6663個(gè)獨(dú)特的8-11-mer肽。無論多抗原接頭狀態(tài)如何，8-11-mer多肽的數(shù)量和每個(gè)等位基因的一般序列特征都是重疊的，并確認(rèn)所提供的多肽符合已知基序。通過檢測來自A*02:01和A*11:01單等位細(xì)胞的對(duì)照病毒表位以及來自8個(gè)不同HLA等位基因的整合藍(lán)色熒光蛋白(BFP)選擇標(biāo)記的表位，證實(shí)了多抗原盒的表達(dá)。

從非靶向分析中，觀察到22個(gè)HLA-新表位和幾個(gè)來自多抗原非突變攜帶區(qū)域的多肽。新表位對(duì)應(yīng)于5個(gè)HLA上15個(gè)共享新抗原，占NetMHC預(yù)測的新表位-HLA對(duì)的~5.4%，占TR-FRET確定的新表位-HLA對(duì)的~3.7%。在22個(gè)新表位-HLA對(duì)中，有10個(gè)是以前在文獻(xiàn)中描述的，其余12個(gè)是基于對(duì)Tantigen、CAatlas和Nedb的搜索和擴(kuò)展的文獻(xiàn)調(diào)查而被認(rèn)為是新的。TR-FRET和NetMHC對(duì)所有22個(gè)識(shí)別的配對(duì)都顯示出極好的一致性；17個(gè)被兩種方法鑒定為結(jié)合體。1對(duì)和3對(duì)新表位-HLA分別被TR-FRET和NetMHC地鑒定為命中，表明每種方法都可以預(yù)測不同的新表位亞群。1對(duì)新表位-HLA(TP53 R175H(HMTEVVRHC)/A*02:01)代表例外，TR-FRET RZ-Score為3.9，NetMHC EL %Rank為3.98，這兩種方法都不被認(rèn)為是成功的，這表明假陰性仍然可能存在。

雖然靶向MS分析將改進(jìn)對(duì)呈現(xiàn)的新表位的檢測，但這依賴于重同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)多肽。因此，需要對(duì)1786個(gè)多肽(47個(gè)新抗原×38個(gè)可能帶有突變的候選新表位) 的邏輯上具有挑戰(zhàn)性的合成，以從單等位細(xì)胞系中篩選所有潛在的新表位。因此，以TR-FRET結(jié)果作為初步篩選，合成了全部397個(gè)具有RZ-Score≥5的多肽。由于TR-FRET和NetMHC結(jié)果的互補(bǔ)性，又合成了81個(gè)RZ-Score<5，Net MHC %Rank≤2的多肽。這479個(gè)多肽被分為15個(gè)等位基因特異庫，包括21-88個(gè)多肽。

靶向MS分析確定了12個(gè)不同等位基因和36個(gè)新抗原的86個(gè)新表位-HLA對(duì)，與非靶向MS分析相比，改進(jìn)了~4倍。在檢索文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫后，確定21個(gè)新表位-HLA對(duì)以前被描述過，65個(gè)是新的。通過非靶向和靶向分析確定的86個(gè)新表位-HLA對(duì)中有20個(gè)與A*11:01相關(guān)。這可能是因?yàn)樵诙嗫乖兄写嬖?/span>8個(gè)不同的KRAS新抗原序列，其中14個(gè)A*11:01特異的新表位和14個(gè)A*03:01特異的新表位被映射到KRAS G12X或G13X新抗原。

為了評(píng)估使用TR-FRET和NetMHC結(jié)果為靶向MS選擇多肽的價(jià)值，為觀察到的86個(gè)新表位-HLA對(duì)中的每一個(gè)繪制了RZ-Score與NetMHC %Rank的圖。這表明，55個(gè)新表位是由TR-FRET穩(wěn)定結(jié)合的，并預(yù)測將由NetMHC提出。13對(duì)新表位-HLA僅在TR-FRET中被發(fā)現(xiàn)為命中，而18對(duì)新表位-HLA僅在NetMHC中被發(fā)現(xiàn)為命中。為了了解僅通過靶向分析確定的新表位-HLA對(duì)的結(jié)合特征，繪制了在非靶向分析和靶向分析中觀察到的多肽與僅在靶向分析中發(fā)現(xiàn)的多肽相比的RZ和NetMHC %Rank分?jǐn)?shù)。與非靶向分析中檢測到的新表位相比，僅通過靶向分析確定的新表位-HLA的NetMHC %Rank和TR-FRET RZ-Score范圍更廣。這表明，靶向分析可以識(shí)別出與非靶向觀察到的新表位相比，結(jié)合較弱的新表位。

靶向MS允許對(duì)新表位的肽呈遞進(jìn)行定量?？傮w而言，測得的新表位呈遞的量從60amol到2.5pmol，并且在細(xì)胞系生長和樣品制備的獨(dú)立重復(fù)中是一致的。用非靶向MS檢測到的兩個(gè)肽，EGFR G719A(ASGAFGTVYK)和FGFR3 S249C(ERCPHRPIL)顯示出高的量。當(dāng)檢測到的新表位的量與每個(gè)等位基因的RZ-Score、NetMHC EL%Rank或NetMHC BA%Rank進(jìn)行比較時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。這表明每個(gè)評(píng)分對(duì)新抗原的呈遞都有預(yù)測價(jià)值，但也不能用來估計(jì)呈遞的量。

多抗原盒設(shè)計(jì)影響新表位呈遞

多抗原序列包括具有已知A*02:01結(jié)合表位的新抗原，以確認(rèn)盒的翻譯、加工和呈遞。這種對(duì)照有可能與實(shí)驗(yàn)中的新表位競爭，從而為假陰性創(chuàng)造途徑。為了評(píng)估這一點(diǎn)，建立了一個(gè)單獨(dú)的A*02:01細(xì)胞系，該細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)一個(gè)沒有對(duì)照序列的非接頭多抗原盒。通過對(duì)非對(duì)照線的分析，檢測到另外兩個(gè)新表位：YVCNTARA(SF3B1 R625C；RZ-Score=16；EL%Rank=5.3)和QLMPFGSLL(EGFR C797S；RZ-Score=7；EL%Rank=0.21)(，帶“X”正方形)。這些結(jié)果表明，強(qiáng)結(jié)合多肽可以抑制某些新表位的呈遞，修改后的工作流程可能會(huì)省略多抗原盒的對(duì)照序列。

在設(shè)計(jì)腫瘤疫苗時(shí)，多抗原盒的長度是一個(gè)重要的考慮因素，考慮到盒的C末端/3‘端的新抗原的翻譯將會(huì)減少，這可能已經(jīng)考慮到在臨床中使用較短的盒(例如，10-mer或34-mer)