lncRNA甲基化通過蛋白質(zhì)軸抑制胃癌干細(xì)胞凋亡

癌癥一直是生物學(xué)研究的熱門話題。關(guān)于癌癥起源，一種主流觀點(diǎn)是癌癥干細(xì)胞（Cancer Stem Cell，CSC）的無限增殖。CSC是腫瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞的一個亞類，具有自我更新和異常分化能力。CSC不僅調(diào)控腫瘤的發(fā)生、傳播和維持，還有助于腫瘤的化療耐藥性和復(fù)發(fā)。因此迫切需要探索影響生物活性的因素，特別是CSC分化。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為基因表達(dá)的調(diào)控因子，在CSCs的細(xì)胞活性中起著關(guān)鍵作用。然而RNA（特別是lncRNA）的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制尚未得到廣泛探索。

N6-甲基腺苷（m6A）可逆修飾在轉(zhuǎn)錄后和翻譯調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。m6A修飾對干細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞的干性維持和分化具有影響。但lncRNA的m6A修飾及其對CSC的影響仍未探索。

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院章曉波教授團(tuán)隊(duì)對胃癌（GC）患者中分離的胃癌干細(xì)胞（GCSCs）和胃癌非干細(xì)胞（GCNSCs）的lncRNA m6A修飾差異進(jìn)行表征，揭示了位點(diǎn)特異性lncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG m6A修飾通過增加miRNAs和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，抑制凋亡和促進(jìn)增殖，從而促進(jìn)GCSCs的腫瘤發(fā)生。

標(biāo)題：Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancer stem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis（甲基化的lncRNA通過lncRNA-miRNA/蛋白軸抑制胃癌干細(xì)胞的凋亡）

時間：2024.4.10

期刊：Cellular & Molecular Biology Letters

影響因子：IF 8.3 / 1區(qū)

實(shí)驗(yàn)方法：MeRIP-seq、MeRIP-qPCR等

研究摘要：

背景：長鏈非編碼RNA（lncRNA）在胃癌的腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。然而，lncRNA甲基化對胃癌干細(xì)胞（GCSC）的影響尚不清楚。

目的：探究lncRNA甲基化在GCSCs中的作用及其對胃癌發(fā)生的貢獻(xiàn)。

方法：

·             通過甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）檢測胃癌干細(xì)胞中lncRNA的N6-甲基腺苷（m6A）水平，并通過MeRIP定量聚合酶鏈反應(yīng)（MeRIP-qPCR）進(jìn)行驗(yàn)證。

·             通過基于單堿基延伸和連接的qPCR擴(kuò)增（SELECT）檢測lncRNA上m6A特異性修飾位點(diǎn)。

·             構(gòu)建并轉(zhuǎn)染與催化失活的Cas13（dCas13b）融合蛋白的表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）質(zhì)粒，并誘導(dǎo)靶向lncRNA特異性甲基化位點(diǎn)的RNA，獲得具有lncRNAs位點(diǎn)特異性甲基化的胃癌干細(xì)胞。

·             使用逆轉(zhuǎn)錄(RT)-qPCR和Western blot分析處理后的胃癌干細(xì)胞的細(xì)胞干性（stemness）。

結(jié)果：

PSMA3-AS1和MIR22HG的位點(diǎn)特異性甲基化抑制了GCSCs的細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其細(xì)胞干性。

LncRNA甲基化增強(qiáng)了PSMA3-AS1和MIR22HG的穩(wěn)定性，通過PSMA3-AS1–miR-411-3p–或MIR22HG–miR-24-3p–SERTAD1軸抑制GCSC的凋亡。

甲基化的lncRNAs促進(jìn)了PSMA3-AS1與EEF1A1蛋白或MIR22HG與LRPPRC蛋白之間的相互作用，穩(wěn)定了蛋白并抑制細(xì)胞凋亡。

體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，甲基化的PSMA3-AS1和MIR22HG觸發(fā)了GCSCs的腫瘤發(fā)生。

結(jié)論：

本研究揭示了lncRNAs位點(diǎn)特異性甲基化在GCSCs腫瘤發(fā)生中的必要性，為癌癥發(fā)展提供了新的見解。

結(jié)果圖形：

（1）GCSC中的lncRNA m6A甲基化

·             GCSC和GCNSC腫瘤球形成百分比。

·             GCSC的單個細(xì)胞的腫瘤球形成分析。

·             用Western blot檢測GCSCs和GCNSCs中干性基因的表達(dá)。

·             GCSC遷移的效率。對GCSC和GCNSC進(jìn)行Transwell遷移測定以檢查細(xì)胞遷移。

·             GCSC的化學(xué)抗性。用不同濃度的順鉑處理GCSC或GCNSC。處理后48小時，對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力測定（**p<0.01）。計(jì)算半數(shù)大抑制濃度（IC50）值。

·             GCSC和GNCSC中RNA的m6A修飾。

·             GCSC和GNCSC中差異表達(dá)的m6A修飾 lncRNA熱圖。

·             甲基化lncRNAs在GCNSCs和GCSCs中的表達(dá)譜。**p<0.01

（2）GCSCs中的lncRNA甲基化機(jī)制

·             從HGC-27（GCSC-HGC）和MGC-803（GCSC-MGC）分選的GCSC單個細(xì)胞的腫瘤球形成測定。

·             GCSC-HGC和GCSC-MGC中干性基因的Western blot分析。

·             GCSC（GCSC-HGC和GCSC-MGC）的遷移能力。用Transwell遷移測定法分析GCSC-HGC、GCNSC-HGC、GCSC-MGC和GCNSC-MGC以檢查細(xì)胞遷移。遷移細(xì)胞的代表性圖像顯示在左側(cè)。遷移細(xì)胞的百分比顯示在右側(cè)（**p<0.01）。

·             GCSC（GCSC-HGC和GCSC-MGC）的化學(xué)抗性效率。用不同濃度的順鉑處理GCSC或GCNSC。處理后48小時，用細(xì)胞活力測定（**，p < 0.01）。計(jì)算半數(shù)大抑制濃度（IC50）值。

·             檢查GCSC中甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14的表達(dá)。

·             用METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救GCSC中METTL3的Western blot。

·             具有METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救的GCSC中lncRNA的m6A水平。

·             使用Western blot檢測METTL3沉默或拯救的GCSC中干性基因的表達(dá)。β-tubulin蛋白用作對照。

·             METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救GCSC中METTL14的Western blot。

·             使用METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救的GCSC中lncRNA的m6A水平。

·             通過Western blot檢測METTL14沉默或拯救的GCSC中干性基因的表達(dá)。**p<0.01

（3）甲基化lncRNAs在GCSCs中的作用

·             GCSC中六種lncRNA（PAPPA-AS1、PSMA3-AS1、MIR22HG、LINC00342、LINC01410和LINC00680）的表達(dá)譜。

·             驗(yàn)證GCSC中lncRNA沉默。

·             用lncRNAs siRNA檢測GCSCs中干細(xì)胞基因的表達(dá)。

·             PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSCs的細(xì)胞活力。

·             PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC的細(xì)胞周期分析。

·             用于PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC的Caspase-3/7檢測。

·             預(yù)測lncRNA的甲基化位點(diǎn)。

·             GCSC和GCNSC之間lncRNA的m6A水平。

·             METTL3沉默的GCSC的m6A水平與lncRNA的位點(diǎn)特異性甲基化。

·             具有lncRNA位點(diǎn)特異性甲基化的METTL3沉默的GCSC的細(xì)胞活力。

·             具有lncRNA位點(diǎn)特異性甲基化的METTL3沉默的GCSC的細(xì)胞周期分析。

·             用于METTL3沉默的GCSC的Caspase-3/7檢測，其具有lncRNA的位點(diǎn)特異性甲基化。

·             Western blot檢測METTL3沉默的GCSCs的干細(xì)胞基因與lncRNAs的位點(diǎn)特異性甲基化。

·             lncRNA位點(diǎn)特異性甲基化的METTL3沉默的GCSC的腫瘤球形成百分比。

·             用甲基化的lncRNA對METTL3沉默的GCSC的單細(xì)胞進(jìn)行腫瘤球形成檢測。**p<0.01

（4）m6A修飾對lncRNAs穩(wěn)定性的影響

·             METTL3沉默的GCSC中lncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG的相對表達(dá)水平。

·             用放線菌素D處理METTL3沉默的GCSCs的lncRNAs穩(wěn)定性。

（5）lncRNAs在GCSCs中的潛在機(jī)制

·             GCSC中的lncRNA-miRNA互作的相對富集。

·             雙熒光素酶報告基因檢測GCSC中潛在的miRNA-lncRNA互作。

·             miR-411-3p和miR-24-3p在GCSCs和GCNSCs中的表達(dá)譜。

·             使用microT、miRmap和TargetScan預(yù)測miRNA的潛在靶基因。

·             驗(yàn)證GCSC中miRNA的過表達(dá)。

·             檢測miRNA過表達(dá)的GCSC中靶基因表達(dá)水平。

·             通過雙熒光素酶報告基因測定驗(yàn)證miRNA與靶基因的互作。

·             GCSCs和GCNSCs中miRNA靶基因的表達(dá)水平。

·             GCSC和GCNSC中miRNA靶基因的Western Blot。

·             用于AP1G1或SERTAD1沉默GCSC的Caspase-3/7檢測。

·             Western Blot分析AP1G1或SERTAD1沉默GCSC中的干性基因。

·             PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中AP1G1或SERTAD1的表達(dá)水平。

·             Western Blot分析PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC中miRNA的靶基因。**p<0.01

（6）m6A修飾的lncRNA與蛋白質(zhì)互作

·             用于lncRNA下拉分析的SDS-PAGE。箭頭表示鑒定出的蛋白質(zhì)。M：protein marker。

·             與lncRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)Western Blot分析。

·             檢測PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中與lncRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

·             GCSC中EEF1A1和LRPPRC的mRNA和蛋白質(zhì)水平。

·             通過RT-qPCR和Western Blot分析驗(yàn)證GCSC中EEF1A1或LRPPRC的沉默。

·             EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的細(xì)胞活力。