機(jī)制探索：干擾素α通過(guò)鐵調(diào)素-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白軸誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極

鐵調(diào)素 (Hepcidin) 是由肝臟產(chǎn)生的鐵調(diào)節(jié)激素。既往安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的王琴教授團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，鐵調(diào)素與聚乙二醇干擾素α（PEG IFNα）治療慢乙肝患者的療效有關(guān)，PEG IFNα治療早期血清鐵調(diào)素水平越高，患者HBsAg和HBV DNA下降的可能性越大。近期，王琴教授及周強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)對(duì)相關(guān)機(jī)制展開(kāi)深入研究，證實(shí)IFNα是通過(guò)激活I(lǐng)L-6/JAK2/STAT3 信號(hào)通路，上調(diào)鐵調(diào)素表達(dá)，并通過(guò)鐵調(diào)素-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白軸誘導(dǎo) M1 巨噬細(xì)胞極化，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗HBV的作用。

研究方法：

本研究通過(guò)水動(dòng)力注射（HDI）HBV質(zhì)粒建立HBV感染小鼠模型，并注射IFNα表達(dá)質(zhì)粒（pIFNα），研究IFNα或鐵調(diào)素對(duì)巨噬細(xì)胞的影響以及IFNα的抗病毒特性。小鼠隨機(jī)分為3組：HBV+IFNα組（注射HBV質(zhì)粒和pIFNα）、HBV組（注射HBV質(zhì)粒）、對(duì)照組（注射生理鹽水）。通過(guò)腹腔注射LMT-28（一種IL-6拮抗劑）進(jìn)行IL-6阻斷實(shí)驗(yàn)。采用細(xì)胞微球芯片技術(shù)分析細(xì)胞因子譜，流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞的極化情況，還分析了IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路與鐵調(diào)素-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白軸（hepcidin-ferroportin axis）的關(guān)系，進(jìn)而探索巨噬細(xì)胞極化機(jī)制。

研究結(jié)果：

1. 經(jīng)IFNα處理后小鼠的血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平下降

與HBV組相比，HBV+IFNα組小鼠的血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平均下降。HBV+IFNα組小鼠的血清HBsAg和HBeAg分別在35 dpi（轉(zhuǎn)染后的天數(shù)）和21 dpi時(shí)為陰性；而在60 dpi時(shí)HBV組的血清HBsAg和HBeAg仍呈陽(yáng)性。

2. IFNα激活IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路，上調(diào)鐵調(diào)素，增加肝內(nèi)鐵蓄積

既往研究表明IFNα上調(diào)鐵調(diào)素的表達(dá)水平。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HBV+IFNα組小鼠的血清IL-6（10和14 dpi）和鐵調(diào)素（10 dpi）水平高于HBV組。免疫熒光和qPCR也證實(shí)小鼠肝內(nèi)鐵調(diào)素表達(dá)增加，尤其是在第7天時(shí)。

既往研究證實(shí)鐵調(diào)素的上調(diào)是通過(guò)IL-6/ JAK2/STAT3信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，本研究在4、7、10 dpi時(shí)檢測(cè)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)組分的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HBV組或?qū)φ战M小鼠相比，HBV+IFNα組小鼠肝組織中IL-6、pSTAT3和鐵調(diào)素的表達(dá)均較高。

鐵調(diào)素-膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白軸（hepcidin-ferroportin axis）可調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，與HBV組或?qū)φ战M相比，HBV+IFNα組小鼠肝臟中的鐵調(diào)素高表達(dá)促使膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FPN）下調(diào)，誘導(dǎo)鐵蛋白上調(diào)。普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)IFNα處理10 dpi時(shí)肝組織產(chǎn)生明顯的藍(lán)色，表明肝臟內(nèi)的鐵蓄積。

3. 鐵調(diào)素的上調(diào)依賴于IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（HepG2-HBV1.3細(xì)胞）表明，經(jīng)IFNα處理后細(xì)胞上清液中IL-6水平升高，鐵調(diào)素和IL-6的mRNA表達(dá)量也上調(diào)，IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，IL-6和pSTAT3表達(dá)增加（圖4A-C）。當(dāng)轉(zhuǎn)染IL-6小干擾RNA（siRNA-IL-6）沉默IL-6的表達(dá)后，細(xì)胞中IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路被抑制，提示siRNA-IL-6轉(zhuǎn)染可下調(diào)鐵調(diào)素的表達(dá)。

加入IL-6拮抗劑（LMT-28）阻斷IL-6的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV+IFNα組小鼠肝組織中p-STAT3和鐵調(diào)素的表達(dá)均下調(diào)，免疫熒光染色分析也證實(shí)阻斷IL-6可下調(diào)HBV+IFNα組小鼠肝組織中鐵調(diào)素的表達(dá)。

上述研究結(jié)果提示IFNα誘導(dǎo)的鐵調(diào)素表達(dá)依賴于IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活。

4. IFNα誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞的極化

檢測(cè)HBV+IFNα組小鼠肝、脾中巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)（檢測(cè)CD86的表達(dá)來(lái)鑒定M1巨噬細(xì)胞；檢測(cè)CD206的表達(dá)鑒定M2型巨噬細(xì)胞）。4、7、10 dpi時(shí)，HBV+IFNα組小鼠肝、脾中巨噬細(xì)胞表面CD86的表達(dá)高于對(duì)照組和HBV組。而在7 dpi時(shí)，HBV+IFNα組小鼠的肝和脾中巨噬細(xì)胞上的CD206表達(dá)均降低

進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)IFNα處理上調(diào)CD16的表達(dá)，下調(diào)CD206的表達(dá)；且上調(diào)鐵調(diào)素表達(dá)，下調(diào)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，誘導(dǎo)鐵蓄積，增加鐵蛋白水平。值得注意的是，IL-6和pSTAT3也被上調(diào)。提示IFNα通過(guò)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)鐵調(diào)素-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白軸激活M1巨噬細(xì)胞的極化。

5. IFNα誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化釋放IL-1β，從而抑制肝細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制

經(jīng)IFNα處理后，與M1巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-1β、IL-12、IL-6）的表達(dá)升高，而TNFα無(wú)明顯變化。且IL-1β mRNA在鐵調(diào)素處理后上調(diào)。進(jìn)一步研究表明IFNα可能通過(guò)觸發(fā)M1巨噬細(xì)胞極化來(lái)釋放IL-1β，從而抑制HBV復(fù)制。

本研究表明IFNα通過(guò)激活I(lǐng)L-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)鐵調(diào)素的表達(dá)，并通過(guò)鐵調(diào)素-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白軸誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的鐵蓄積，促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而發(fā)揮抗HBV的作用。

近年來(lái)，學(xué)界對(duì)于IFNα/PEG IFNα抗HBV的作用機(jī)制研究正在不斷深入，這也將有助于進(jìn)一步優(yōu)化治療方案，提高臨床治率，使更多患者獲益。