磷脂雙分子層輔助的疏水氨基酸的縮聚研究

【摘要】  目的：研究磷脂雙分子層對疏水氨基酸色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸縮聚反應(yīng)的影響。方法：活化氨基酸的聚合反應(yīng)在囊泡體系和對照緩沖溶液中進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物用高效液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分離檢測。結(jié)果：兩種體系中都有氨基酸的縮聚產(chǎn)物_寡肽的生成。結(jié)論：對磷脂雙分子膜親合力較強(qiáng)的氨基酸，磷脂雙分子層對其縮聚反應(yīng)顯示了明顯的輔助作用。

【關(guān)鍵詞】  磷脂雙分子層 氨基酸 寡肽 縮聚反應(yīng)

　　Liposome_Assisted Polycondensation of Hydrophobic α_Amino Acids

　　ZHANG Lu_mian, ZHUANG Wen_sheng, YANG Jian_feng, LIU Dao_jun

　　(Department of Chemistry, Shantou University Medical College, Shantou  515041, China;Chaoyang No.1 Middle School Mingguang School, Chaoyang  515100, China)

　?。跘bstract］ob[x]jective: To investigate the effect of lipidic bil[x]ayers on the polycondensation of hydrophobic amino acids(trptophan, phenylalanine, methione, leucine, isoleucine, and valine). Methods: The polycondensation of amino acids in liposome system as well as in aqueous buffer solution was started from amino acid_N_carboxyanhydrides(NCAs). The reaction products were analyzed with HPLC_MS. Results: Amino acid_NCAs oligomerize into polypeptides in both systems. Conclusion: The presence of lipidic bil[x]ayers can assist the polycondensation of amino acids to varying extent depending on their membrane affinity.

　?。跭ey Words］liposome; amino acid; oligopeptides; polycondensation

　　對生命起源的化學(xué)研究實(shí)際上是基于如何從簡單分子和簡單反應(yīng)創(chuàng)造出功能化的復(fù)雜分子。1953年Miller模擬遠(yuǎn)古條件合成了氨基酸，從而走出了分子進(jìn)化的步［1］。但低分子量的分子還沒有解決生命如何起源的問題，需要進(jìn)一步探討功能化大分子(如蛋白質(zhì)和核酸)的形成［2］。有報(bào)道，過磷脂雙分子層(囊泡)對色氨酸的縮聚反應(yīng)有明顯的輔助作用［3,4］。本文將系統(tǒng)研究疏水氨基酸色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)的縮聚反應(yīng)，通過比較不同結(jié)構(gòu)的疏水氨基酸在磷脂雙分子層體系和對照緩沖溶液中的反應(yīng)，總結(jié)氨基酸與磷脂雙分子層的相互作用對氨基酸縮聚反應(yīng)的影響。

　　1  材料與方法

　　1.1  儀器與試劑
   
　　HP1050 LC高效液相色譜(HPLC)_HP1100 MSD質(zhì)譜(MS)聯(lián)用儀(惠普公司，美國)。棕櫚硬脂酰磷酯酰膽堿(POPC)和11′_羰基二咪唑(CDI)(Sigma_Aldrich公司，美國)。氨基酸及其它試劑均為分析純。

　　1.2  方法
   
　　POPC囊泡體系的制備、氨基酸_N_羰基_環(huán)內(nèi)酸酐(氨基酸_NCA)的聚合反應(yīng)以及HPLC和MS分析方法［4］：將POPC溶解在氯仿中，常壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，隔夜真空干燥；然后加入一定量的咪唑(0.4mol/L)/鹽酸(對照)緩沖溶液(pH　6.80)，分別在液氮中冷凍、40℃水浴中解凍，重復(fù)冷凍解凍過程10次制得POPC囊泡體系。將氨基酸(40mmol/L)溶解在對照緩沖溶液中；氨基酸溶液與過量2.5倍的CDI在0℃下反應(yīng)2min；得到的氨基酸_NCA溶液(40mmol/L)將其分別與對照緩沖溶液和POPC囊泡體系(40mmol/L)按1∶1(v∶v)混合，在室溫下震蕩12h，得到的產(chǎn)物用HPLC_MS聯(lián)用儀分離檢測，其條件同文獻(xiàn)［4］。

　　2  結(jié)果

　　2.1  氨基酸_NCA的制備及聚合反應(yīng)機(jī)理
   
　　氨基酸的縮聚反應(yīng)從氨基酸_NCA開始。氨基酸_NCA及其硫代物可能是生命起源之前存在的化合物［5～7］。氨基酸溶液與CDI反應(yīng)產(chǎn)物的MS檢測結(jié)果證實(shí)了存在氨基酸_NCA和N_咪唑羰基氨基酸，說明氨基酸與CDI的反應(yīng)及其后續(xù)的縮聚反應(yīng)是依照Ehler等［8］提出的機(jī)理進(jìn)行的(圖1)。

　　圖1  氨基酸_NCA的制備及其聚合成寡肽的反應(yīng)（略）

　　Fig.1  Preparation of amino acid_NCA and its polymerisation into oligopeptides

　　2.2  不同結(jié)構(gòu)疏水氨基酸的縮聚反應(yīng)
   
　　將新鮮制備的氨基酸_NCA溶液與對照緩沖溶液和POPC囊泡體系混合，在室溫下振蕩12h。此時(shí)MS分析檢測不到氨基酸_NCA和N_咪唑羰基氨基酸，說明氨基酸_NCA的聚合反應(yīng)完成。反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC和MS進(jìn)行分離和檢測。典型的Phe縮聚產(chǎn)物的HPLC圖見圖2，從中可以看到明確分離的組分峰。由MS檢測可知組分峰為寡聚Phe，其聚合度用數(shù)字在每一組分峰上部標(biāo)出。通過測量組分寡肽峰在215nm(寡聚色氨酸在280nm下測量)的吸光度值且對時(shí)間積分可以近似對寡肽的產(chǎn)率進(jìn)行定量分析(假定每個(gè)氨基酸單體的摩爾吸光系數(shù)在聚合成寡肽后近似不變)。各氨基酸縮聚后生成的寡肽的組分峰面積(對應(yīng)寡肽的產(chǎn)率)隨聚合度變化的關(guān)系見圖3。

　　圖2  緩沖溶液(A)和POPC囊泡體系(B)中寡聚Phe產(chǎn)物的HPLC色譜圖（略）

　　Fig.2  HPLC chromatograms of products of oligo_Phe in reference buffer(A)and in liposome(B)

　　圖3  POPC囊泡對不同氨基酸的縮聚產(chǎn)物色譜峰面積(產(chǎn)率分布)的影響（略）

　　Fig.3  Effect of POPC liposomes on peak areas(yields distribution)of oligopeptides obtained from polycondensation of amino acids

　　從圖2、3中可以看出，在對照緩沖溶液和POPC囊泡體系中氨基酸_NCA都縮聚生成不同聚合度的寡肽。但POPC囊泡體系的存在對寡肽的產(chǎn)率和分布具有不同程度的影響，其明顯地提高了高聚合度的寡聚Trp、寡聚Phe和寡聚Met的產(chǎn)率，但對寡聚Leu、寡聚Ile和寡聚Val的產(chǎn)率和分布影響不大。例如，對照緩沖溶液中可檢測到的聚合度高的寡聚Phe為7聚體，但在POPC囊泡體系中可明顯檢測到10聚體的生成。而且，POPC囊泡體系中聚合度較高的Phe(5聚體或更高)的產(chǎn)率明顯高于對照緩沖溶液中的產(chǎn)率。

　　3  討論
   
　　POPC囊泡對氨基酸縮聚反應(yīng)的不同程度的輔助作用可以用POPC雙分子層與氨基酸的相互作用(即氨基酸的親膜性)來解釋。氨基酸的親膜性可用將氨基酸從水相轉(zhuǎn)移到POPC界面的自由能變ΔG來衡量［9］。Trp、Phe、Met、Leu、Ile和Val的ΔG分別為-1.85,-1.13,-0.83,-0.56,-0.31和0.07kJ/mol［9］。因此可以解釋為：具有較低的ΔG值或親膜性較強(qiáng)的氨基酸可以在POPC雙分子層界面處富集，因此具有較高的局部濃度，有利于較高聚合度的寡肽的生成。另一方面，由親膜性氨基酸形成的寡肽也具有高的親膜性和溶解度，因此富集于POPC雙分子層界面，并在此延長生成高聚合度的寡肽。例如，Trp具有高的親膜性，因而觀察到POPC囊泡對其縮聚反應(yīng)的顯著的輔助作用。Leu、Ile和Val的親膜性較弱，沒有明顯觀察到POPC囊泡對其縮聚反應(yīng)的輔助作用。
   
　　綜上所述，本文研究了不同疏水氨基酸(Trp、Phe、Met、Leu、Ile和Val)_NCA在對照緩沖溶液和POPC囊泡體系中的縮聚反應(yīng)。HPLC和MS等研究表明，兩種體系中都生成了寡肽，POPC雙分子層的存在可以選擇性地輔助親膜性較強(qiáng)的氨基酸的縮聚反應(yīng)。

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作者：張魯勉

作者單位：汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室