兩種基因轉(zhuǎn)染方法對(duì)外源基因在心肌組織中表達(dá)的影響

作者：雷娟,伍衛(wèi),薛聲能,鄭韶欣　　作者單位：中山大學(xué) 1. 附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科， 廣東 廣州 510120， 2. 附屬第五醫(yī)院心血管內(nèi)科， 廣東 珠海 519000

　　【摘要】【目的】 比較兩種基因轉(zhuǎn)染方法對(duì)外源基因在心肌組織中表達(dá)的影響?！痉椒ā?20只SD大鼠隨機(jī)分為尾靜脈注射(IV)組和心肌內(nèi)注射(IM)組各10只，分別于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前后在體轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的腺病毒，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光在心肌組織中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】 術(shù)后存活的6只IV組大鼠心肌組織在腺病毒轉(zhuǎn)染后24 h和14 d均觀察不到綠色熒光，但在其肝臟組織中檢測(cè)到大量綠色熒光表達(dá)。術(shù)后存活的7只IM組大鼠注射部位心肌在腺病毒轉(zhuǎn)染后24 h和14 d均檢測(cè)到綠色熒光表達(dá)，而肝臟組織內(nèi)未見綠色熒光?！窘Y(jié)論】 心肌內(nèi)注射法能夠使外源基因在心臟組織中特異性地高表達(dá)，而靜脈注射法卻不能。

　　【關(guān)鍵詞】 靜脈注射法; 心肌內(nèi)注射法; 基因治療

　　Effect of Two Transfection Methods on Foreign Gene ex[x]pression in Myocardium

　　LEI Juan1， WU Wei2， XUE Sheng-neng1， ZHENG Shao-xin1

　　(1. Department of Cardiology， The Second Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120， China;

　　2. Depart ment of Cardiology， The Fifth Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Zhuhai 519000， China)

　　Abstract： 【ob[x]jective】 To compare the effect of two transfection methods on foreign gene ex[x]pression in myocardium. 【Methods】 Twenty SD rats were randomized to tail intravenous injection group (IV) and intramyocardial injection group (IM). There were 10 rats in each group. Adenovirus carrying green fluorescence protein (AdGFP) was transferred into rats before and after coronary artery ligation. Green fluorescence expressing in myocardium was observed by fluorescent microscopy after transferring AdGFP. 【Results】 There were six rats survived after operation in Ⅳ group. No green fluorescence could be observed in myocardium. However， there were abundant green fluorescence in liver 24 hours and 14 days after AdGFP transfection. There were seven rats survived after operation in IM group. Green fluorescence could be observed in myocardium， while little could be observed in liver 24 hours and 14 days after AdGFP transfection. 【Conclusion】 Intramyocardial injection makes exogenous gene highly express in myocardium specifically， while tail intravenous injection can not.

　　Key words： intravenous injection; intramyocardial injection; gene therapy

　　基因治療作為一種新的治療策略，在心血管疾病的治療中顯示出廣闊的前景[1]。如何選擇合適的方法對(duì)體內(nèi)心肌細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染，使外源基因表達(dá)局限在心肌細(xì)胞等靶細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到心臟疾病基因治療的目的，又避免目的基因在其他組織器官表達(dá)引起副作用，以確?；蛑委煹陌踩蔀槟壳搬t(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[2]。本研究選用重組缺陷腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體，比較當(dāng)前主流的兩種在體基因轉(zhuǎn)染方法對(duì)外源基因在心肌組織中表達(dá)的影響，為今后合理選擇基因轉(zhuǎn)染方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料與分組

　　清潔級(jí)雄性Spreague-Dawley(SD)大鼠20只，體質(zhì)量250 ～ 300 g(275 ± 15.3)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為尾靜脈注射(IV)組和心肌內(nèi)注射(IM)組。攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的腺病毒(adenovirus carrying green fluorescent protein，AdGFP)購于北京諾賽基因組研究中心有限公司。

　　1.2 心肌梗死動(dòng)物模型的制作

　　參照文獻(xiàn)[3]制作大鼠心肌梗死模型，根據(jù)心電圖和心肌組織顏色確定冠脈結(jié)扎成功。

　　1.3 腺病毒在體轉(zhuǎn)染

　?、買V組：冠脈結(jié)扎術(shù)前，取100 μL滴度為2 × 1010 PFU的AdGFP，用生理鹽水稀釋至1 mL，于尾靜脈內(nèi)注入，隨后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈[4]。②IM組：冠脈結(jié)扎術(shù)后，取100 μL滴度為2 × 1010 PFU的AdGFP，用微量注射器沿梗死邊緣區(qū)選取10個(gè)點(diǎn)行心肌內(nèi)注射(每點(diǎn)10 μL)[5]。

　　1.4 心肌及肝臟組織綠色熒光表達(dá)的檢測(cè)

　　分別于轉(zhuǎn)染后24 h時(shí)和14 d處死大鼠，立即取出心臟和肝臟，冰鹽水洗凈血跡后行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況(操作過程注意避光)。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 大鼠生存情況

　　10只IV組大鼠，尾靜脈注射時(shí)死亡1只，冠脈結(jié)扎術(shù)中死于心室顫動(dòng)和心跳呼吸驟停3只，存活6只。10只IM組大鼠，冠脈結(jié)扎術(shù)中死亡2只，心內(nèi)注射時(shí)死亡1只，存活7只。

　　2.2 兩組大鼠心肌組織綠色熒光表達(dá)情況的比較

　　IV組大鼠心肌在AdGFP轉(zhuǎn)染后24 h和14 d均未檢測(cè)到綠色熒光表達(dá)。IM組大鼠心肌在AdGFP轉(zhuǎn)染后24 h即可檢測(cè)到綠色熒光，主要集中在病毒注射部位;AdGFP轉(zhuǎn)染后14 d仍可檢測(cè)到綠色熒光表達(dá)，但較前有所減弱(圖1)。

　　2.3 兩組大鼠肝臟組織綠色熒光表達(dá)情況的比較

　　IV組大鼠肝臟組織在AdGFP轉(zhuǎn)染24 h后可見大量綠色熒光表達(dá);IM組大鼠肝臟組織在AdGFP轉(zhuǎn)染24 h未見綠色熒光表達(dá)(圖2)。

　　3 討 論

　　眾所周知，基因治療成功的關(guān)鍵在于外源基因能夠在心肌組織中特異性地高表達(dá)。然而，由于心臟結(jié)構(gòu)和血流動(dòng)力學(xué)的特殊性，并非每一種轉(zhuǎn)染方法都能夠?qū)崿F(xiàn)心肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。選擇何種方法對(duì)體內(nèi)心肌細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染，成為心臟疾病基因治療研究的熱點(diǎn)。

　　在體基因轉(zhuǎn)染的方法有多種，但由于心臟結(jié)構(gòu)的特殊性，并非每一種方法都適用于心臟疾病的基因治療。靜脈注射法雖然操作簡便、易行，符合臨床應(yīng)用的要求，但由于目前所用的載體對(duì)心肌細(xì)胞的靶向性不強(qiáng)，經(jīng)血液稀釋后對(duì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率很低，使其在心臟疾病的基因治療中受到限制。有學(xué)者通過靜脈注射重組腺病毒的方法對(duì)小鼠體內(nèi)的骨骼肌和心肌進(jìn)行長期基因轉(zhuǎn)染，注射15 d僅有0.2%的新生鼠心肌細(xì)胞得到了轉(zhuǎn)染[6]。冠狀動(dòng)脈注入法雖然可以較高的滴度實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌的基因轉(zhuǎn)移[7]，但只適用于大動(dòng)物。心包注射法雖然符合心肌靶向性的要求，但由于存在心包臟層肌膜的屏障，使載體對(duì)心肌的感染僅局限在心外膜下。研究證實(shí)[8]，將載體注射入心包腔內(nèi)進(jìn)行對(duì)心肌的轉(zhuǎn)染，在心包壁層和左心房組織可觀察到外源基因的表達(dá)，而在左、右心室僅見低水平的表達(dá)。

　　心肌內(nèi)注射法不但操作簡單，而且很容易實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，對(duì)局部的心肌具有較高的轉(zhuǎn)染效率，是體內(nèi)心肌基因轉(zhuǎn)染的理想途徑。雖然有學(xué)者認(rèn)為，心肌內(nèi)注射時(shí)外源基因僅局限于注射部位，不能實(shí)現(xiàn)心肌廣泛的基因轉(zhuǎn)移，使其在基因治療中受到限制[9]。但由于心臟結(jié)構(gòu)和病變的特殊性，常常并不需要外源基因在心肌內(nèi)廣泛表達(dá)。例如在病態(tài)竇房結(jié)綜合征和心肌梗死的基因治療中，治療者希望導(dǎo)入的外源基因集中表達(dá)在竇房結(jié)和梗死邊緣區(qū)，此時(shí)心肌內(nèi)注射法顯示出其它基因轉(zhuǎn)染法不能與之比擬的獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。

　　本研究結(jié)果顯示，尾靜脈注射法雖然可以將外源基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，并在體內(nèi)加以表達(dá)，但是外源基因主要集中在肝臟，基本不在心肌組織中表達(dá)，這樣難以達(dá)到心臟疾病基因治療的目的。與國外研究結(jié)果一致[10]。心肌內(nèi)注射法能夠按照實(shí)驗(yàn)者的意愿，嚴(yán)格控制外源基因表達(dá)的部位，使其在目標(biāo)部位特異性地高水平表達(dá)，而其他部位和心臟外組織不表達(dá)或者少表達(dá)，從而達(dá)到減少副作用，確?；蛑委煱踩哪康摹Ｐ募?nèi)注射法是某些心臟疾病基因治療時(shí)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的理想途徑。

　　考慮到心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)還選用了重組缺陷腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體。腺病毒具有轉(zhuǎn)染效率高、對(duì)外源DNA片段容量大的特性。它不僅能感染分裂期的細(xì)胞，而且能感染終末分化的細(xì)胞，非常適合對(duì)體內(nèi)外心肌細(xì)胞的感染[11]。心肌內(nèi)注射法與腺病毒載體的聯(lián)合應(yīng)用，更有助于提高外源基因在心肌組織中的表達(dá)，提高基因治療的成功率。