Velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡研究

　　作者：陳麗娟,李建勇,錢(qián)思軒,朱廣榮　　作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院血液科，南京
　　多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種漿細(xì)胞克隆性增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，多發(fā)生于老年人。隨著社會(huì)人口的老齡化，其發(fā)病率呈逐漸增高的趨勢(shì)。幾十年來(lái)對(duì)MM一直采用激素和細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合治療，盡管近年來(lái)加用反應(yīng)停抑制血管新生治療或采用自體骨髓移植治療，但其仍是一種不可治愈的血液系統(tǒng)腫瘤。由此可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)新的治療方法有重要的臨床價(jià)值。蛋白酶體抑制劑近年來(lái)作為MM新的治療制劑用于臨床試驗(yàn)，本研究就臨床新藥蛋白酶體抑制劑velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞的凋亡作用進(jìn)行探討。
　　材料和方法
　　細(xì)胞培養(yǎng)

　　U266細(xì)胞置于含10%的熱滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司產(chǎn)品) 中，于37℃、5% CO2和95%空氣濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞以(2-5)×105 細(xì)胞/毫升的密度接種培養(yǎng)，并與不同濃度velcade一起進(jìn)行孵育，對(duì)照加DMSO。細(xì)胞活率由臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)，根據(jù)處理組存活細(xì)胞數(shù)與死細(xì)胞數(shù)的比例來(lái)計(jì)算。形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞用cytospin (Shandon，Runcorn，UK)收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。生長(zhǎng)抑制率及細(xì)胞活率按如下公式計(jì)算：
　　生長(zhǎng)抑制率 =[(對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-處理組細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)]×　存活率=[活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))]×

　　Annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基(ROS)的流式細(xì)胞儀分析

　　Annexin-V 分析

　　使用FITC標(biāo)記的Annexin V和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，根據(jù) Becton Dickinson Biosciences 公司提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。簡(jiǎn)單地說(shuō)，取(1-2)×105 細(xì)胞，經(jīng)PBS 漂洗后加100 μl 結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，加5 μl AnnexinV-FITC，10μl PI 避光孵育15 分鐘后加400 μl 結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　線粒體跨膜電位(Δψm)檢測(cè)
　　取5×105細(xì)胞，用PBS清洗1次，加入10 μg/ml Rh123(Sigma公司產(chǎn)品)37℃孵育30分鐘，用PBS漂洗1次，加入終濃度10 μg/ml PI 4℃暗處放置30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　活性氧測(cè)定 細(xì)胞內(nèi)活性氧測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行，DCFHDA (Sigma公司產(chǎn)品)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF 熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。DCF 的激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，吸收波長(zhǎng)為530 nm。將藥物處理的細(xì)胞(1×105)經(jīng)過(guò)PBS洗滌，重懸于1 ml含有10 μmol/L DCFHDA的PBS中，以未加染料的樣品作為對(duì)照，37℃孵育20分鐘，以PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)5 000個(gè)活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
　　velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266 bcl-2 mRNA表達(dá)的半定量RT-PCR檢測(cè)
　　細(xì)胞總RNA抽提 收集3×106細(xì)胞，用TRIzoL試劑(Gibco BRL產(chǎn)品)按說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA。
　　cDNA 合成及PCR 擴(kuò)增 方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[ 2 ]，PCR引物：GAPDH：有義鏈5′-GAAGGTGAAGGT CGGAGTCA-3′;反義鏈5′-GAAGATGGTGATGG GATTTC-3′。bcl-2: 有義鏈5 ′-ACTTGTGGCCCA GATAGG-3′，反義鏈為5′-CGACTTCGCCGAGAT GTC-3′。PCR 產(chǎn)物用6 %聚丙烯酰胺凝膠電泳分析照相，在雙波長(zhǎng)色譜掃描儀上掃描電泳帶。GAPDH片段長(zhǎng)度216 bp，bcl-2片段389 bp。
　　結(jié) 果
　　velcade對(duì)U266細(xì)胞增殖抑制和殺傷作用
　　研究結(jié)果表明，velcade可以抑制U266細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)伴有細(xì)胞活率的降低。U266細(xì)胞經(jīng)2、10、50和100 nmol/L濃度velcade 24小時(shí)處理后生長(zhǎng)抑制率的3次均值分別為18.7%、45.45%、59.86%和68.9%，48小時(shí)時(shí)分別為34.45%、61.46%、73.75%和82.04%;在0、2、10、50和100 nmol/L濃度時(shí)24小時(shí)活率分別為97.31%、91.38%、79.91%、61.48%和42.62%，48小時(shí)時(shí)分別為96.57%、76.60%、58.41%、30.40%和14.05%。根據(jù)活率48小時(shí)時(shí)下降70%-80%選擇藥物濃度，因此選擇velcade 50 nmol/L作為藥物處理濃度(圖1)。
　　velcade對(duì)U266細(xì)胞凋亡作用

　　50 nmol/L velcade處理的U266細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為染色體凝聚、細(xì)胞核破裂而細(xì)胞膜保持完整及出現(xiàn)多個(gè)凋亡小體等(圖2A)。24小時(shí)Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞比例重復(fù)3次的均值為61.3%，明顯高于未用velcade處理對(duì)照組的3.56%(圖2B)。線粒體跨膜電位(△ψM)檢測(cè)顯示△ψM降低，Rh123陽(yáng)性細(xì)胞比率重復(fù)3次的均值為56.3%，對(duì)照為95.02%(圖2C)。
　　活性氧檢測(cè)
　　我們采用DCFHDA檢測(cè)velcade處理的U266細(xì)胞活性氧及平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12小時(shí)時(shí)活性氧明顯增高，平均熒光強(qiáng)度顯著增高，由對(duì)照的1.95增強(qiáng)到10.8，流式細(xì)胞儀直方圖右移(圖3)。
　　bcl-2檢測(cè)
　　采用RT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路主要的基因bcl-2。結(jié)果顯示，U266細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L velcade處理后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)逐漸降低(圖4)。
　　討 論
　　泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway，UP通路)是由泛素化系統(tǒng)和蛋白酶體組成，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和腫瘤生長(zhǎng)中有著重要的作用，該通路參與細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)的蛋白降解，如許多重要的涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)蛋白。蛋白酶體存在于所有的真核細(xì)胞中，蛋白酶體抑制劑可以通過(guò)干涉這些重要蛋白的降解，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而使腫瘤進(jìn)展延緩或靜止[3-7]。
　　Velcade 是一種硼酸二肽化合物，是高選擇性、可逆性的26S蛋白酶體抑制劑，首先在美國(guó)國(guó)家腫瘤協(xié)會(huì)的一組60種腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出抗腫瘤作用。velcade對(duì)MM細(xì)胞的作用表現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞黏附和骨髓血管生成等多個(gè)方面。本研究顯示，其對(duì)U266細(xì)胞具有增殖抑制作用，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加呈現(xiàn)增殖抑制加強(qiáng)，活率降低趨勢(shì)。
　　誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有3種信號(hào)通路：FAS信號(hào)通路、線粒體信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路，目前認(rèn)為線粒體途徑在凋亡過(guò)程發(fā)揮樞紐作用。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會(huì)被破壞，發(fā)生磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由內(nèi)層向外層的翻轉(zhuǎn)，暴露在外面的磷脂酰絲氨酸可被周?chē)耐淌杉?xì)胞識(shí)別、吞噬，從而使凋亡細(xì)胞得以被清除。
　　Annexin V 為一種磷脂結(jié)合蛋白，可特異性地識(shí)別細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，所以經(jīng)常被用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡[8]。Rh123 是一種親脂性陽(yáng)離子，可發(fā)射綠色熒光，它可被線粒體吸收，并且其吸收量與線粒體△ψm成正比[9]。正常的活細(xì)胞因?yàn)榫€粒體△ψm高，所以其攝入的Rh123 也高，因此細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光。而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)線粒體△ψm會(huì)降低，細(xì)胞表現(xiàn)為Rh123 低染。本研究結(jié)果顯示，Velcade處理U266細(xì)胞24小時(shí)時(shí)凋亡細(xì)胞明顯增高，△ψm明顯降低，這說(shuō)明細(xì)胞大部分是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而死亡的，Velcade還可通過(guò)線粒體信號(hào)通路，即內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。
　　ROS 是細(xì)胞有氧呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的一些小分子物質(zhì)，主要包括O-2 、OH-及其活性衍生物如H2O2 、HOCl 、O2等。這些物質(zhì)具有較高的反應(yīng)活性，易與細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的廣泛損傷，如膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)及核酸等的氧化損傷等。近年的研究認(rèn)為，活性氧是細(xì)胞凋亡的信號(hào)之一，ROS的產(chǎn)生可直接或間接改變線粒體膜電位，促進(jìn)Cyt C從線粒體內(nèi)釋放，啟動(dòng)線粒體信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中同樣會(huì)有ROS的生成。Fribley 等報(bào)道[11]蛋白酶體抑制劑velcade通過(guò)同時(shí)誘導(dǎo)ER應(yīng)激(stress)和ROS生成引起人頭頸癌細(xì)胞凋亡，ROS的抑制劑Tiron能夠顯著抑制凋亡，caspase-9和caspase-3的活化，并且能夠阻礙ER應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表達(dá)。這些結(jié)果提示，ROS在ER 應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。用DCFHDA 作為熒光探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS 水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)velcade在24小時(shí)時(shí)能明顯增高U266細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，這說(shuō)明velcade可改變多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，導(dǎo)致線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生ROS增多，從而誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。由此我們推測(cè)，不僅線粒體途徑參與了velcade誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡，而且ER應(yīng)激途徑也可能通過(guò)ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。
　　bcl-2基因是抗細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，其表達(dá)的增高與多種腫瘤有著密切關(guān)系，并且可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗糖皮質(zhì)激素、柔紅霉素、阿糖胞苷及VP16等化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，使腫瘤細(xì)胞對(duì)各種化療藥物耐受，導(dǎo)致緩解率低[12]。bcl-2表達(dá)降低在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡即線粒體信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，很多化療藥物可通過(guò)抑制bcl-2基因表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了bcl-2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)水平降低，并隨著velcade藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)量逐漸減少，這一結(jié)果從分子水平進(jìn)一步證實(shí)了velcade的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及其作用機(jī)制主要是通過(guò)線粒體信號(hào)通路。