內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡途徑在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡過程中的作用

作者：胡潔　何冬花　高良　楊春虎,蔡真　　作者單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科骨髓移植中心,杭州 310003;浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物電磁學(xué)省重點實驗室,杭州 310009

　　【摘要】本研究探討高三尖杉酯堿 ( Homoharringtonine, HHT )誘導(dǎo)人MDS細(xì)胞株MUTZ-1細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。 以HHT處理骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株MUTZ-1(MDS-RAEB), 用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和線粒體膜電位變化，應(yīng)用RT-PCR檢測HHT處理前后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)的基因(CHOP,BIP,XBP1)的表達(dá)情況。 結(jié)果表明： 0.05 μg/ml HHT作用MUTZ-1細(xì)胞的凋亡率隨著時間的延長而增加，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);激光共聚焦結(jié)果顯示， 0.05 μg/ml HHT作用后4小時胞漿內(nèi)Ca2+濃度增高，12小時達(dá)高峰，其后開始下降; HHT作用后線粒體膜電位持續(xù)下降; CHOP以及 BIP,XBP1基因表達(dá)增強(qiáng)，12小時達(dá)到高峰，其后開始下降。 結(jié)論: HHT可以誘導(dǎo)MDS細(xì)胞株MUTZ-1凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡途徑在其中發(fā)揮了重要的作用。
　　【關(guān)鍵詞】 高三尖杉酯堿; MDS細(xì)胞株MUTZ-1 ; 細(xì)胞凋亡; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

　　Role of Endoplasmic Reticulum Pathway in Apoptosis of MDS Cells Induced by Homoharringtonine　HU Jie, HE Dong-Hua, GAO Liang, YANG Chun-Hu， CAI Zhen　Department of Hematology, Bone Marrow Transplantation Center, The First Affiliated Hospital, Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310003, China; 1Zhejiang Provincial Key Laboratory of Bioelectromagnetics,Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310009, China

　　AbstractThe study was aimed to investigate the apoptotic mechanism of homoharringtonine (HHT) on MDS cell line ( MUTZ-1 cells ). The apoptosis of MUTZ-1 cells induced by HHT was measured by flow cytometry. The concentration of cystosolic calcium was measured with the mitochondrial membrane potential by confocal . The mRNA ex[x]pression level of CHOP, BIP and XBP1 were detected by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that after exposure of MUTZ-1 to HHT for different hours , the percentage of apoptotic MUTZ-1 cells increased in a time dependent manner. Typical apoptotic cells and release of Ca2+ from the cytosolic Ca2+ storage and the loss of mitochondrial membrane potential were observed. RT-PCR analysis revealed that mRNAs for endoplasmic reticulum (ER) stress-associated proapoptotic factor CHOP and ER chaperone BIP, XBP1 markedly increased at 4 hours after treatinent with 0.05 μg/ml HHT and reached the top level at 12 hours, and then decreased. It is concluded that HHT not only inhibits MUTZ-1 growth but also induces MUTZ-1 apoptosis. The HHT-induced MUTZ-1 cell death is likely mediated by the ER stress pathway.

　　Key wordshomoharringtonine; MUTZ-1 cell; apoptosis; ER stress

　　骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組異質(zhì)性的造血干細(xì)胞疾病，病理生理學(xué)改變?yōu)樵煅绑w細(xì)胞成熟障礙和過度增殖，易于向白血病轉(zhuǎn)化[1,2], 其發(fā)病和治療機(jī)制是目前臨床研究的熱點。高三尖杉酯堿(HHT)是我國自主研制成功的高效抗白血病藥物[3]，臨床上用來治療MDS取得一定的療效，本研究組前期工作表明HHT主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗白血病作用[4], 我們進(jìn)一步研究表明，在此過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮了重要的作用。
　　材料和方法
　　主要試劑

　　HHT(1 mg/ ml) 購自杭州民生藥廠，在使用之前用RPMI 1640(RPMI 1640干粉購自Gibco公司) 稀釋至所需濃度。Fluo3/AM 購自美國Biotum公司，JC-1購自Sigma公司，Annexin-V/PI , Mito-tracker, ER-tracker購自Molecular probe公司， 鼠抗人熒光二抗購自Cell signal公司。
　　細(xì)胞培養(yǎng)

　　人MDS 細(xì)胞系MUTZ-1引自德國Brauschweig 細(xì)胞中心[5] ;在5 % CO2 、37 ℃條件下,于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)傳代, 實驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。
　　細(xì)胞凋亡的測定
　　采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行Annexin V/PI雙標(biāo)記測定。取經(jīng)HHT處理后的各組細(xì)胞，調(diào)整濃度為2.0×105/ml，加入 Annexin V/FITC 5 μl 和 PI 0.5 ml，室溫避光30分鐘，用 PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測。
　　細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化的共聚焦激光掃描顯微鏡檢測[6]

　　收集處理后的各組細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，加入fluo3/AM(終濃度為5 μmol/L), 37℃下避光溫育35分鐘，Hanks液洗滌2次。用Laica-TCSSP激光共聚焦掃描顯微鏡對細(xì)胞內(nèi)鈣進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射光為527 nm。
　　線粒體膜電勢變化的共聚焦激光掃描顯微鏡檢測[7]

　　JC-1 為一種特異性的陽離子熒光染料,可定位在線粒體膜上,其激發(fā)光為490 nm,單體發(fā)射光為527 nm,多聚體發(fā)射光為590 nm,其聚集程度與膜電位成正比。當(dāng)線粒體膜電位增高時,紅色熒光增強(qiáng),紅色熒光和綠色熒光的比值可代表膜電位的高低。收集不同處理組的細(xì)胞, 用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，然后與10 μg/ml JC-1 37℃負(fù)載30分鐘, PBS洗2次后用共聚焦顯微鏡檢測。以紅色熒光值與綠色熒光值的比值的大小來表示膜電位的高低。
　　凋亡前因子CHOP基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)基因BIP,XBP1 mRNA表達(dá)水平的RT-PCR檢測
　　引物： CHOP(357 bp)上游5'-AGTCATTGCCTTTC-TCTTCG-3'， 下游5'-GGTGCAGATTCACCATTCGG-3'; BIP(231 bp)上游 5'-ATCACGCCGTCCTATGTCGC-3'; 下游5'-TCTCCCCCTCCCTCTTATCC-3'; XBP1(441 bp)上游 5'-CCTTGTAGTTGAGAACCAGG-3'， 下游5'-GGGGCTTGGTATATATGTGG-3'; β-actin(619 bp)上游: 5'-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3， 下游: 5'-GTCACG CAC GATTTCCCGCT-3'。反應(yīng)條件： 94℃ 3分鐘;94℃ 30秒; 58℃ 30秒; 72℃ 45分鐘，共30個循環(huán); 72℃延伸10分鐘。 PCR產(chǎn)物用1.5%的凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。
　　統(tǒng)計學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)用±SD表示, 用SPSS 12.0分析， P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示有顯著意義。
　　結(jié)果

　　細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果
　　0.05 μg/ml HHT作用后0，6,12及24小時MUTZ-1細(xì)胞的凋亡率分別為(0.63±0.59)%， (5.07±1.38)%，(10.21±5.79)%，(22.52±6.55)%，凋亡率隨著時間的延長而增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1A、B)。
　　細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變
　　0.05 μg/ml HHT作用4小時后, MUTZ-1培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度即明顯增加， 12小時達(dá)高峰，其后開始下降 。統(tǒng)計學(xué)分析資料表明, 加入HHT后的MUTZ-1培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+ ] i與空白對照組相比有顯著性差異(P <0.01)(表1，圖2)。Table 1. Fluo-3/AM fluorescence of MUTZ-1 cells treated with HHT (略)

　　細(xì)胞膜電位的變化

　　正常MUTZ-1細(xì)胞的表面大多呈均勻的橙紅色,顯示綠色熒光的細(xì)胞較少;而經(jīng)過HHT處理的細(xì)胞胞體增大、綠色熒光增強(qiáng),表明細(xì)胞受到損傷其線粒體膜電位有所下降。 HHT處理后細(xì)胞紅、綠熒光值的比值和正常對照組比較4小時后開始下降，8小時后較為明顯，48小時后細(xì)胞凋亡測不出。統(tǒng)計學(xué)分析表明0.05 μg/ml HHT作用8小時后的MUTZ-1培養(yǎng)細(xì)胞與空白對照組相比差異具有顯著性意義(P< 0.01) (表2，圖3)。Table 2. Dynamic change of mitochondrial membrane potential (Δψm) in MUTZ-1 cells treated with HHT (略)

　　凋亡相關(guān)基因RT-PCR結(jié)果

　　MUTZ-1細(xì)胞靜息狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因CHOP基因不表達(dá)，BIP, XBP-1基因少量表達(dá)，0.050 μg/ml HHT作用4小時后即開始表達(dá)增強(qiáng)，12小時達(dá)高峰，24小時表達(dá)量下降，48小時測不出，各組與空白對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4A、B)。
　　討論

　　高三尖杉酯堿(HHT)是我國自主研制成功的高效抗白血病藥物，主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,其確切機(jī)制是目前研究的熱點。本實驗應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MUTZ-1細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且HHT引起MUTZ-1細(xì)胞凋亡是時間依賴性的。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在其凋亡過程中也發(fā)揮了重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)細(xì)胞凋亡是不同于受體介導(dǎo)(TNFR,Fas)或線粒體介導(dǎo)DNA損傷的另一種新的細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞凋亡相聯(lián)系表現(xiàn)在兩個方面;一是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對Ca2+的調(diào)控，二是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。 大量實驗表明，很多細(xì)胞在凋亡早期會出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度迅速持續(xù)的升高，這種濃度升高來源于細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))的釋放。相對高濃度的Ca2+一方面可以激活胞質(zhì)中的鈣依賴性蛋白酶(如鈣蛋白酶calpain)，另一方面可以作用于線粒體，影響其通透性的改變，進(jìn)而促進(jìn)凋亡[9，10]。 本研究以Fluo-3/AM為指示劑,采用激光掃描共聚焦顯微鏡法測定細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+ ,結(jié)果發(fā)現(xiàn)人MUTZ-1細(xì)胞受HHT作用后4小時細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度開始增加,8小時后增高更為顯著,12小時達(dá)高峰，其后開始下降，但仍高于靜息狀態(tài)，表明HHT作用后出現(xiàn)鈣超載。本研究同時也以JC-1作為指示劑，用激光掃描共聚焦顯微鏡法測定用藥前后細(xì)胞線粒體膜電位的改變，結(jié)果顯示用藥后，線粒體膜電位持續(xù)下降。因此我們推測HHT作用于MUTZ-1細(xì)胞，引起MUTZ-1細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的早期升高，但終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣庫耗竭，線粒體膜電位的持續(xù)下降，細(xì)胞凋亡發(fā)生。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)聚集就會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因表達(dá)激活，當(dāng)未折疊蛋白質(zhì)過度聚集變成有毒性時就會觸發(fā)細(xì)胞凋亡。信號主要通過caspase -12下傳。鈣蛋白激酶CHOP(C/EBP homologus protein)基因也參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-12]。我們的結(jié)果表明，0.05 μg/ml HHT能誘導(dǎo)CHOP基因和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因BIP,XBP-1表達(dá)增加， 表明HHT作用于MUTZ-1后誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)發(fā)生，從而引起MUTZ-1細(xì)胞凋亡的發(fā)生?？傊?，本實驗結(jié)果表明，HHT可以誘導(dǎo)MDS細(xì)胞株MUTZ-1凋亡， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡途徑在其中發(fā)揮了重要的作用，但線粒體相關(guān)的凋亡途徑也與之關(guān)系密切。進(jìn)一步研究兩者的關(guān)系將是我們下一步所要研究的課題。
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