環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展及其在病原檢測(cè)中的應(yīng)用

　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本學(xué)者Notomi一于2000年建立的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)。近年來該技術(shù)在不斷的改進(jìn)和完善過程中被廣泛應(yīng)用于各種病原檢測(cè)，本研究就LAMP技術(shù)進(jìn)展和病原檢測(cè)應(yīng)用這兩方面研究進(jìn)展進(jìn)行綜述如下。 　　

1LAMP技術(shù)的進(jìn)展
　　1.1檢測(cè)反應(yīng)的加速提高檢測(cè)反應(yīng)的速度，縮短病原檢測(cè)用時(shí)對(duì)于疾病的快速診斷和對(duì)癥治療具有重要意義。 　　

Nagamin。等發(fā)現(xiàn)在LAMP反應(yīng)體系中增加2條與擴(kuò)增產(chǎn)物莖環(huán)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的環(huán)引物能夠有效地提高擴(kuò)增反應(yīng)速度，顯著縮短檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間。Tanner等「31在多重LAMP技術(shù)的研究中使用Bst2.0DNA聚合酶替代傳統(tǒng)的BstDNA聚合酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示能夠縮短約50%的檢測(cè)時(shí)間。新一代聚合酶是通過對(duì)BstDNA聚合酶進(jìn)行大量計(jì)算模擬優(yōu)化之后推出的，具有酶促反應(yīng)更快，產(chǎn)量更高，對(duì)緩沖體系耐受能力更廣，熱穩(wěn)定性更好的優(yōu)點(diǎn)。這些研究和應(yīng)用增強(qiáng)了LAMP技術(shù)在疾病快速檢測(cè)的應(yīng)用潛力。 　　

　　1.2L檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果判讀的可視化早期的LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀方法與PCR相同，均為對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、嗅化乙吮染色進(jìn)行判斷。Mori等〔發(fā)現(xiàn)LAMP反應(yīng)在合成DNA的同時(shí)伴有副產(chǎn)物焦磷酸根離子生成并與反應(yīng)緩沖液中的Mgz+離子結(jié)合生成不溶于水的焦磷酸鎂，反應(yīng)后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行離心能夠使沉淀更為明顯可見，便于肉眼判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果;對(duì)焦磷酸鎂的產(chǎn)量和反應(yīng)合成DNA的產(chǎn)量之間的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示二者的產(chǎn)量呈線性相關(guān)。Iwamoto等[s〕在反應(yīng)完成后加人SYBRGreenI熒光染料，能與雙鏈DNA分子結(jié)合，通過觀察擴(kuò)增產(chǎn)物溶液是否從橘黃變?yōu)榫G色來判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。熒光染料顯色方法靈敏度高，但反應(yīng)結(jié)束后添加染料的操作容易造成產(chǎn)物氣溶膠擴(kuò)散，引起后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性。Boehme等在配制反應(yīng)體系時(shí)加人指示劑鈣黃綠素，擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的焦磷酸根離子與金屬離子結(jié)合降低了緩沖液的金屬離子濃度使得鈣黃綠素轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)，在紫外光照射下發(fā)出綠色熒光。反應(yīng)結(jié)束后只需紫外燈照射便可讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，避免實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染。Tomit。等〔}l對(duì)鈣黃綠素顯色法進(jìn)行了改進(jìn)，在反應(yīng)體系添加MnCh使得鈣黃綠素顯色反應(yīng)在可見光下也可以觀察，通過肉眼觀察擴(kuò)增產(chǎn)物溶液是否從淺黃色變?yōu)榫G色來判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Goto等「8〕引入了另一種金屬離子指示劑經(jīng)基蔡酚藍(lán)，通過對(duì)Mgz+離子濃度變化進(jìn)行監(jiān)測(cè):反應(yīng)中焦磷酸鎂沉淀造成了Mgz十離子濃度降低，經(jīng)基蔡酚藍(lán)指示劑發(fā)生相應(yīng)的顏色變化，反應(yīng)結(jié)束后以在可見光下觀察溶液是否由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色作為結(jié)果判斷的依據(jù)。鈣黃綠素和經(jīng)基蔡酚藍(lán)顯色法的應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)結(jié)果可以在可見光下觀察反應(yīng)前后溶液顏色變化來判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室污染并降低了儀器需求，使之更適于現(xiàn)場(chǎng)以及儀器配置不足的城鎮(zhèn)級(jí)別醫(yī)院、疾控中心進(jìn)行病原檢測(cè)工作。 　　

　　1.3檢測(cè)反應(yīng)的高通量化近年來以多重PCR、基因芯片、液相芯片技術(shù)為代表高通量檢測(cè)逐漸成為病原檢測(cè)篩查的熱點(diǎn)，LAMP反應(yīng)只能檢測(cè)一種病原的局限也得到改進(jìn)。早期的多重LAMP檢測(cè)方法是在引物中增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切、電泳鑒定酶切產(chǎn)物條帶大小及數(shù)量來判斷擴(kuò)增結(jié)果，但處理步驟耗時(shí)費(fèi)力，未能推廣。Li等一9開發(fā)了組合LAMP方法是將各種反應(yīng)單元進(jìn)行組合以提高檢測(cè)通量，可以同時(shí)檢測(cè)6種蟲媒病毒，但沒有合并減少反應(yīng)數(shù)量，不能降低檢測(cè)成本。Liang等「io〕在基于分子條碼和焦磷酸測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)建立了多重LAMP檢測(cè)方法，在內(nèi)引物F1P引人的分子條碼能被內(nèi)切酶識(shí)別并產(chǎn)生缺口，缺口在焦磷酸測(cè)序反應(yīng)中被修補(bǔ)并釋放信號(hào)，達(dá)到多重檢測(cè)的目的。由于焦磷酸測(cè)序法只能產(chǎn)生A'CCG對(duì)應(yīng)的4種熒光信號(hào)，所以這個(gè)方法大檢測(cè)通量為4重。Tanner等[37通過引人熒光探針建立了多重LAMP檢測(cè)方法，用熒光淬滅基團(tuán)修飾內(nèi)引物FIP，反應(yīng)前先通過變性一退火使得熒光探針與引物FIP結(jié)合，此時(shí)熒光信號(hào)被屏蔽;將FIP一熒光探針二聚體用于LAMP反應(yīng)，熒光探針在反應(yīng)中被Bst聚合酶置換下來成為游離狀態(tài)，在激發(fā)光照射下釋放熒光實(shí)現(xiàn)了多重檢測(cè)，反應(yīng)能檢測(cè)的病原數(shù)量由具體使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光通道數(shù)量決定，一般為4重以上，但這個(gè)方法也增加了對(duì)儀器的依賴性。 　　

　　1.4檢測(cè)樣品處理方法的簡化標(biāo)本的核酸提取是核酸類檢測(cè)方法的前提工作，需要相應(yīng)的人力物力和時(shí)間。簡化樣品處理的操作步驟既能降低檢測(cè)成本，縮短檢測(cè)用時(shí)，對(duì)提高應(yīng)對(duì)突發(fā)急性傳染的快速診斷能力具有現(xiàn)實(shí)意義。 　　

　　Kanek。等{川在研究單純疙疹病毒和水痘一帶狀疤疹病毒檢測(cè)時(shí)進(jìn)行了樣品直接檢測(cè)研究，60份臨床標(biāo)本中提取病毒DNA后進(jìn)行LAMP方法和PCR方法檢測(cè)，檢出率分別為41/60和37/60;臨床標(biāo)本不提取核酸，直接進(jìn)行LAMP方法和PCR方法檢測(cè)，檢出率分別為26/60和1/60。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PCR方法更容易受到樣品中復(fù)雜成分影響，LAMP方法寬容度更好，耐受性更強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更為穩(wěn)定，說明簡化樣品處理方法對(duì)于LAMP技術(shù)具有實(shí)用價(jià)值。早期實(shí)驗(yàn)中使用免疫捕獲技術(shù)、直接包被結(jié)合方法等樣品吸附方法替代了核酸提取，但由于吸附流程耗時(shí)，未能推廣。Yamamur。等〔iz〕使用了DNA濾紙對(duì)全血進(jìn)行吸附，洗除雜質(zhì)后將濾紙作為LAMP檢測(cè)的模板，這個(gè)方法縮短樣品處理時(shí)間、簡化操作，還能使不具備檢測(cè)能力的衛(wèi)生機(jī)構(gòu)能將臨床標(biāo)本進(jìn)行簡易處理后送至上級(jí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，有效提高工作效率。Curb。等[‘3在檢測(cè)HIV時(shí)進(jìn)行了對(duì)血漿和血液標(biāo)本滅活后直接檢測(cè)的研究，處理方案經(jīng)過優(yōu)化調(diào)整，對(duì)血漿標(biāo)本進(jìn)行1:3稀釋后1000C滅活5min，對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行1:5稀釋后1170C滅活5min，然后進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，能直接、有效檢出HIV,整個(gè)檢測(cè)用時(shí)縮短為90minxNie等’使用熱裂解方法對(duì)咽拭子樣品的處理，處理方案為標(biāo)本與反應(yīng)體系95℃加熱30s，冰浴冷卻后加人聚合酶、染料，可直接檢測(cè)人手足口病主要病原人腸道病毒71型。 　　

　　1.5引物設(shè)計(jì)引物組的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證是LAMP技術(shù)起始工作的重點(diǎn)。引物組由2條外引物、2條內(nèi)引物和2條環(huán)引物組成，其中每條內(nèi)引物針對(duì)2個(gè)區(qū)域，這6條引物針對(duì)了靶基因的8個(gè)區(qū)域，在提高引物特異性的同時(shí)也給引物設(shè)計(jì)增加了難度。目前研究人員廣泛使用的引物設(shè)計(jì)軟件主要是基于JAVA的在線設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV4，該免費(fèi)軟件存在不能同步設(shè)計(jì)環(huán)引物、序列長度不能超出2000帥、需要單獨(dú)安裝JAVA控件、只能使用瀏覽器在線設(shè)計(jì)等局限，而且軟件不具備引物特異性檢驗(yàn)的功能，設(shè)計(jì)完成后仍需要手工進(jìn)行Blast比對(duì)驗(yàn)證來排除誤判。Tome、等[”〕開發(fā)的基于Perl語言開源程序LAVA既可以同步設(shè)計(jì)環(huán)引物，還可以就多序列比對(duì)進(jìn)行分析和引物設(shè)計(jì);但是LAVA只能在Unix/Linu、界面下運(yùn)行，在使用中也受到一定的限制。查磊等”fi]
　　

　　采用Delphi語言開發(fā)了BiosunLAMP軟件，在設(shè)計(jì)LAMP引物組的同時(shí)能進(jìn)行引物特異性檢驗(yàn)，還能夠針對(duì)多序列比對(duì)信息進(jìn)行通用型和特異型引物的設(shè)計(jì)。商業(yè)化的LAMPDesigner軟件具有LAMP引物設(shè)計(jì)、引物Blast驗(yàn)證特異性、引物組錯(cuò)配驗(yàn)證等功能，還具有較好的數(shù)據(jù)庫管理能力，但因?yàn)檐浖r(jià)格高昂并沒有在研究人員中得到普及推廣。 　　

2LAMP技術(shù)在病原檢測(cè)中的應(yīng)用 　　

　　2.1呼吸道病原檢測(cè)進(jìn)人21世紀(jì)以來，SARS、禽流感等呼吸道傳播疾病對(duì)人類健康、社會(huì)穩(wěn)定造成嚴(yán)重威脅。對(duì)這些突發(fā)傳染病病原的快速檢測(cè)對(duì)于疾病預(yù)防控制，維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定具有重要現(xiàn)實(shí)意義。Hong等[n〕建立針對(duì)SARS-CoV的LAMP檢測(cè)方法只需要63℃反應(yīng)1h，與傳統(tǒng)RT-PCR方法相比較，檢測(cè)反應(yīng)的靈敏度提高了100倍，檢測(cè)限達(dá)到0.O1PFU。李啟明等〔LB」設(shè)計(jì)了高致病禽流感HSNI的HA,NA引物，檢測(cè)靈敏度達(dá)到100拷貝，與其他亞型流感病毒無交叉反應(yīng)，而且NA引物組與H1N1型流感病毒反應(yīng)呈陰性，顯示引物組具有的高特異性。在2009年全球HINI流感大流行暴發(fā)后建立了針對(duì)人甲型H1N1流感病毒HA基因的RT-LAMP檢測(cè)方法，可在1h內(nèi)獲得結(jié)果，檢測(cè)限為60拷貝，與其他型別流感病毒無交叉反應(yīng)，并通過加人經(jīng)基茶酚藍(lán)指示劑增強(qiáng)了檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果判讀的可視化。Nie等f2G〕在2013年H7N9禽流感暴發(fā)后建立了針對(duì)該病毒HA和NA基因的RT-LAMP檢測(cè)方法，該方法與H1N1,H3N2,HSNI等流感病毒均無交叉反應(yīng)，在5份H7N9患者臨床標(biāo)本的檢測(cè)中與國家流感中心雙重RealtimeRT-PCR一致。 　　

　　2.2胃腸道病原檢測(cè)近年來手足口病和感染性腹瀉病一直高居丙類法定傳染病報(bào)告發(fā)病數(shù)前三位，對(duì)人類健康尤其兒童生命安全造成嚴(yán)重危害二Ni。等川對(duì)手足口病主要病原，人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型的VP1基因設(shè)計(jì)引物，R'I'-LAMP檢測(cè)反應(yīng)經(jīng)過柯薩奇病毒A組、B組和埃可病毒組等多種腸道病毒驗(yàn)證無交叉反應(yīng)，檢測(cè)的靈敏度分別為0.33TCIDS。和1.58TCIDSG，與RealtimeRT-PCR靈敏度相當(dāng)。Jiang等‘”〕建立的HEV71病毒檢測(cè)方法，RT-LAMP檢測(cè)反應(yīng)與其他型別腸道病毒無交叉，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.O1PFU,40份臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示該方法靈敏度和特異性分別為92.9%和。 　　
　　2.3蟲媒病毒檢測(cè)蟲媒病毒是以節(jié)肢動(dòng)物為媒介在脊椎動(dòng)物中傳播的病毒，病毒種類多樣，能引起乙型腦炎、登革熱等多種疾病。Parida等〔z3〕對(duì)登革病毒1-4型分別設(shè)計(jì)了以病毒3‘非編碼區(qū)為檢測(cè)對(duì)象的引物，建立了登革病毒型特異性的RT-LAMP檢測(cè)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)顯示能區(qū)分登革病毒的4種血清型，與乙型腦炎病毒、西尼羅病毒、圣路易斯腦炎病毒等無交叉反應(yīng);與病毒分離方法比較，靈敏度和特異性分別為和93%oToriniw。等〔zap以乙型腦炎病毒E蛋白基因?yàn)榘谢蚪⒘薘T-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度為1PFU，與傳統(tǒng)RT-PCR方法相當(dāng)，并與登革病毒、西尼羅病毒無交叉反應(yīng)。 　　

L1等I9]通過組合RT-LAMP反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)登革1-4型病毒、乙型腦炎病毒和西尼羅病毒，通過168份臨床標(biāo)本和279份蚊蟲標(biāo)本的檢測(cè)，該檢測(cè)方法特異性達(dá)到了，靈敏度高于傳統(tǒng)RT-PCR方法100倍。 　　

　　2.4其他重大傳染病病原檢測(cè)艾滋病、肝炎、腫瘤等是關(guān)系到整個(gè)社會(huì)公共健康、社會(huì)秩序穩(wěn)定的重大公共衛(wèi)生問題，針對(duì)這些疾病的檢測(cè)技術(shù)研究和應(yīng)用具有重要的社會(huì)意義。Curti。等〔”〕針對(duì)艾滋病病原HIV病毒1型的蛋白酶基因及P24蛋白基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物，RT-LAMP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HIV-1的DNA和RNA的靈敏度分別為100和10拷貝DNA分子，1000和100拷貝RNA分子。Cai等[25〕使用建立了檢測(cè)乙型肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-LAMP方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方法95%置信區(qū)間下檢測(cè)限為210拷貝/ml，能達(dá)到8個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍。Yang等[26〕針對(duì)丙型肝炎病毒的5’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，并引人加速引物(acceleratingprimer,AP)，建立檢測(cè)HCV的AP-LAMP檢測(cè)方法，該方法的檢測(cè)限為84IU/mloIwat。等[z}〕建立了檢測(cè)鼻咽癌病原EB病毒的LAMP檢測(cè)方法，在108份疑似患者臨床標(biāo)本的檢測(cè)中以血清學(xué)診斷方法為金標(biāo)準(zhǔn)，平行使用LAMP和RealtimePCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示LAMP方法檢測(cè)的靈敏度和特異性分別是86.4%和,RealtimePCR方法的分別是84.1%和98.4%,LAMP方法略優(yōu)于RealtimePCR方法。 　　

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