脫落細(xì)胞檢測(cè)方法在口腔癌早期診斷中的應(yīng)用研究

作者：劉彤 孫正 首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔黏膜科；張辛燕 首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所

癌癥是影響人類(lèi)健康和生存的重大疾病。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，在2012年癌癥共造成820萬(wàn)人死亡，其中約70%發(fā)生在中低收入國(guó)家。中國(guó)作為大的發(fā)展中國(guó)家，人口眾多、老齡化明顯，醫(yī)療資源分布不均和相對(duì)缺乏，這些因素都加劇了癌癥對(duì)民眾造成的負(fù)擔(dān)。
目前，大多數(shù)癌癥的診斷和癌前病變程度的判定主要依靠臨床醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)和病理診斷。臨床醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)需要長(zhǎng)期臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，主觀性強(qiáng)；病理診斷雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但活檢是有創(chuàng)檢查，檢測(cè)的可重復(fù)性也受到限制。脫落細(xì)胞檢測(cè)是一種簡(jiǎn)便、容易為患者所接受的非侵入性檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于宮頸、口腔和體腔等各種臟器脫落物的檢測(cè)。脫落細(xì)胞學(xué)檢查是取病變組織表面脫落細(xì)胞或混懸于液體中的細(xì)胞制成涂片，染色后進(jìn)行顯微鏡檢查并做出細(xì)胞學(xué)診斷。一般情況下，癌組織的代謝比正常組織高，脫屑較正常細(xì)胞快，癌細(xì)胞彼此間的凝聚力是正常細(xì)胞的1/10，故可通過(guò)癌細(xì)胞脫屑做出細(xì)胞學(xué)診斷。脫落細(xì)胞學(xué)檢查先用于宮頸癌的早期診斷，之后應(yīng)用范圍逐漸加大，成為診斷早期癌的重要手段。
在傳統(tǒng)的脫落細(xì)胞學(xué)檢查中制片方法多為直接涂片，其中標(biāo)本除受到體液新鮮程度、脫落細(xì)胞數(shù)量、涂片厚薄均勻度等因素影響外，還因未經(jīng)加工處理導(dǎo)致背景不清晰，影響診斷，導(dǎo)致漏診。液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（thinprep cytologic test，TCT）是20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，為宮頸刷片、痰、漿膜腔積液等標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷提供了可靠依據(jù)。TCT技術(shù)是1996年由美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床，它是一種將脫落細(xì)胞保存于液體中，并通過(guò)機(jī)械、氣動(dòng)和流體力學(xué)原理，用自動(dòng)設(shè)備將細(xì)胞均勻、分散地涂于載玻片上的一種制片技術(shù)。TCT制片法的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在以下幾方面：①去除了標(biāo)本中的黏液、血液等，因而背景較干凈；同時(shí)，制片過(guò)程始終處于液態(tài)環(huán)境，保存了細(xì)胞的完整性；②制片機(jī)程序化制片，嚴(yán)格控制涂片的細(xì)胞量，細(xì)胞均勻分布；③閱片面積小，不易發(fā)生視疲勞，減少漏診；④自動(dòng)制片減少了污染及人為干擾因素，提高了診斷的準(zhǔn)確性與可靠性；⑤能更多地收集標(biāo)本中的細(xì)胞成分，保證涂片中的細(xì)胞數(shù)量。應(yīng)用TCT技術(shù)制片具有細(xì)胞采樣量大、標(biāo)本質(zhì)量高、涂片薄而均勻、陽(yáng)性檢出率高等特點(diǎn)，是將制片影響減少到低的一種行之有效的方法。
一、傳統(tǒng)口腔黏膜脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)
口腔癌具有較高的發(fā)病率和死亡率，其中90%以上是鱗狀細(xì)胞癌?？谇话╊A(yù)后較差，5年生存率小于50%，甚至經(jīng)過(guò)手術(shù)治療的患者其5年生存率也僅為58.5%。而早期發(fā)現(xiàn)的口腔癌，其復(fù)發(fā)的比例可以減少10%~20%?？谇话┣安∽兓虬┣盃顟B(tài)，如口腔白斑、紅斑、口腔黏膜下纖維化等已被證實(shí)有較高的轉(zhuǎn)化為口腔癌的概率?？谇话┰缙跓o(wú)自覺(jué)癥狀，可以無(wú)惡性表現(xiàn)，使得口腔檢查結(jié)果不可靠。
口腔黏膜具有更新快、易脫落的特點(diǎn)，在刷牙等外力作用下口腔黏膜細(xì)胞可以脫落到載體刷毛上。一般情況下，可以通過(guò)癌細(xì)胞脫屑做出細(xì)胞學(xué)診斷。然而，此方法也有一定的局限性，如異常值的出現(xiàn)、假陽(yáng)性結(jié)果等。因此，應(yīng)重復(fù)進(jìn)行脫落細(xì)胞學(xué)檢查，采用一套標(biāo)準(zhǔn)化的程序進(jìn)行檢測(cè)，包括刷取確切部位的樣本，掌握福爾根染色（Feulgen staining）技術(shù)以及的圖像采集。近年來(lái)，不斷發(fā)展的新技術(shù)已應(yīng)用于口腔癌的脫落細(xì)胞學(xué)診斷中。
二、口腔黏膜脫落細(xì)胞學(xué)的定性和定量分析

1．DNA指數(shù)（DNA index，DI）值的定性分析：

正常人體的各種體細(xì)胞DNA含量是恒定的，大多為二倍體，而腫瘤細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)較多的非二倍體細(xì)胞。福爾根反應(yīng)（Feulgen reaction）可以顯示DNA，顯色的強(qiáng)度與DNA含量相關(guān)。顯色強(qiáng)度可用分光光度儀、數(shù)字圖像分析儀等計(jì)算DI值。加拿大BC省腫瘤中心（BC Cancer Agency，BCCA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①樣本中DI值>2.3的細(xì)胞為異倍體細(xì)胞，出現(xiàn)5個(gè)及以上異倍體細(xì)胞；②10%的異常增生細(xì)胞；③出現(xiàn)異倍體峰。以上3條滿(mǎn)足1條即為陽(yáng)性結(jié)果。脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)聯(lián)合DNA定量分析已常規(guī)用于口腔癌的診斷，據(jù)報(bào)道其診斷的敏感性和特異性均達(dá)到。有研究表明，與組織學(xué)診斷相比，細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)和DNA定量分析結(jié)合可以提前3年以上預(yù)測(cè)癌的發(fā)生。因此，DNA異倍體可以作為口腔癌發(fā)生的早期標(biāo)志物，提示臨床醫(yī)師該病變需要組織學(xué)檢查確診和手術(shù)。本課題組在2010至2015年進(jìn)行脫落細(xì)胞DNA定量分析研究，脫落細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)對(duì)口腔癌及癌前病變?cè)\斷的敏感性為95.12%，特異性為98.20%。聯(lián)合VELscope Vx照射診斷的敏感性為，特異性為97.44%。
2．口腔癌變風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（oral cancer risk index，OCRI）的定量分析：
對(duì)于那些癌前病變的DNA指數(shù)判定為"不典型"的病例，既不能將其定義為"陽(yáng)性"，也不能定義為"陰性"。因此需要對(duì)其進(jìn)行定量分析，計(jì)算OCRI，指導(dǎo)臨床醫(yī)師制訂治療方案。本課題組在2013至2015年進(jìn)行口腔黏膜脫落細(xì)胞在口腔白斑癌變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用研究，利用脫落細(xì)胞DI值成功建立EdTAR（expert-guided data transformation and reconstruction）數(shù)據(jù)處理方法，并重建數(shù)據(jù)，選擇支持向量機(jī)（support vector machine）統(tǒng)計(jì)模型計(jì)算OCRI，平均隨訪(fǎng)時(shí)間為46個(gè)月，全部低OCRI口腔白斑患者均未發(fā)生癌變；其中1例病理結(jié)果為口腔白斑伴輕度異常增生的患者OCRI為0.88，經(jīng)過(guò)40個(gè)月的隨訪(fǎng)，同一部位發(fā)生癌變，病理結(jié)果為口腔鱗狀細(xì)胞癌中分化。此結(jié)果證明脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法可用于口腔白斑癌變風(fēng)險(xiǎn)的定量評(píng)估，且在臨床應(yīng)用中具有可行性，從方法學(xué)上驗(yàn)證了該技術(shù)可應(yīng)用于口腔癌前病變的癌變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
三、口腔黏膜脫落細(xì)胞在分子生物學(xué)診斷中的應(yīng)用
1．人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）檢測(cè)：

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)及美國(guó)國(guó)家研究所于2011年宣布HPV-16是口咽鱗狀細(xì)胞癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。盡管HPV在口咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生中起重要作用，但在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚存在爭(zhēng)議。以往研究中，HPV在口腔鱗狀細(xì)胞癌及口腔癌前病變中的檢測(cè)率波動(dòng)較大，且尚無(wú)一致結(jié)論。這樣的波動(dòng)可能是由樣本類(lèi)型、檢測(cè)手段及地理位置的差異等原因造成。研究表明，HPV初通過(guò)肝素硫酸鹽介導(dǎo)附著于上皮細(xì)胞，HPV感染基底細(xì)胞后，病毒基因大量表達(dá)，并在每個(gè)細(xì)胞中形成10~20個(gè)拷貝數(shù)的病毒DNA，保持在未分化的基底細(xì)胞中，隨著基底細(xì)胞的分裂，病毒分段進(jìn)入子細(xì)胞，感染病毒的子細(xì)胞移入顆粒細(xì)胞層分化，裝配完的病毒終從表層的細(xì)胞中釋放出去，這種感染特點(diǎn)使得成熟病毒濃度高的地方是病損表面，因而直接從病損表面采樣對(duì)于HPV的檢測(cè)更具敏感性。Lawton等對(duì)3種取樣方法進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，含漱、搔刮比活檢方法所獲標(biāo)本的陽(yáng)性率更高。魏清躍和錢(qián)成明在瘤體表面取脫落的瘤體上皮細(xì)胞作為標(biāo)本，HPV的檢出率與用瘤體組織作為標(biāo)本的檢出率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，臨床上可以用脫落細(xì)胞取代瘤體組織，提取細(xì)胞DNA并進(jìn)行分子生物學(xué)診斷，在獲取標(biāo)本時(shí)不僅更簡(jiǎn)便快捷，而且還具有無(wú)創(chuàng)性，患者容易接受。
2．其他輔助口腔癌早期診斷的分子生物學(xué)指標(biāo)：
細(xì)胞分子標(biāo)志物的改變多發(fā)生在癌變?cè)缙?，分子生物學(xué)技術(shù)有望成為一項(xiàng)診斷口腔癌的基本技術(shù)，這些分子標(biāo)志可用于早期診斷口腔癌，促進(jìn)口腔癌的早期診斷、早期治療并用于流行病學(xué)調(diào)查。脫落細(xì)胞學(xué)技術(shù)可以快速、簡(jiǎn)單獲取分子生物學(xué)診斷所需的DNA標(biāo)本。目前可應(yīng)用脫落細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的指標(biāo)：①與細(xì)胞增殖相關(guān)的標(biāo)志物，如增殖細(xì)胞核抗原、核仁組成區(qū)嗜銀蛋白、端粒酶等；②與細(xì)胞凋亡相關(guān)的標(biāo)志物，如存活蛋白、環(huán)氧化物酶2等；③癌變相關(guān)基因，如p53基因及其表達(dá)產(chǎn)物、ras基因、cmyc癌基因、Rb基因等；④染色體畸變，如微衛(wèi)星標(biāo)志及雜合性缺失、DNA含量等。
脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是一種簡(jiǎn)便、易被患者接受的非侵入性檢測(cè)方法。目前，該技術(shù)除用于婦科標(biāo)本外，正逐步擴(kuò)展到非婦科細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域，如食管、胃脫落細(xì)胞、口腔黏膜脫落細(xì)胞、糞便腸脫落細(xì)胞、痰液脫落細(xì)胞、尿液與腦脊液脫落細(xì)胞。TCT與傳統(tǒng)涂片技術(shù)相比，可以提高異常細(xì)胞的檢出率，是檢測(cè)脫落癌細(xì)胞的可靠手段。
口腔黏膜脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)以其無(wú)創(chuàng)性、操作簡(jiǎn)便的取材方式，高敏感性的檢測(cè)特點(diǎn)，通過(guò)DNA定量分析計(jì)算DI值，采用多參數(shù)分析以及統(tǒng)計(jì)學(xué)模型構(gòu)建計(jì)算OCRI，實(shí)現(xiàn)了對(duì)口腔癌及癌前病變的定性、定量分析，適用于口腔病變的人群普查、腫瘤早期診斷和療效監(jiān)測(cè)等，其對(duì)臨床相關(guān)疾病的診斷和治療有重要意義。此外，脫落細(xì)胞學(xué)技術(shù)可用于快速、簡(jiǎn)單地獲取分子生物學(xué)診斷所需的DNA標(biāo)本，應(yīng)用于分子生物學(xué)診斷，特別是HPV檢測(cè)。隨著各種新技術(shù)的發(fā)展以及臨床醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的緊密結(jié)合，必將進(jìn)一步促進(jìn)癌癥的早期診斷與治療。
來(lái)源：中華口腔醫(yī)學(xué)雜志2017年第52卷第3期