一種快速評估過繼轉(zhuǎn)移的工程TCR-T細胞在體內(nèi)多功能性的方法

CAR和TCR T細胞免疫療法的臨床療效歸因于它們在體內(nèi)的增殖和持久性。由于經(jīng)過工程改造的T細胞與靶向腫瘤或其微環(huán)境的相互作用可能會抑制其功能，因此應(yīng)在自體移植前和移植后對其功能進行表征。杜克-新加坡國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院和來恩生物通過改進開發(fā)的一種SARS-CoV-2快速全血T細胞檢測方法，在小體積全血（<1mL）中刺激經(jīng)過工程改造的TCR T細胞，而無需進行體外細胞純化，以實現(xiàn)這一目標(biāo)。作為概念驗證，使用這種方法縱向研究了2名接受多次劑量遞增輸注的、具有瞬時功能的mRNA工程HBV-TCR T細胞治療的原發(fā)性乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)肝細胞癌患者。結(jié)果證明，簡單地用對應(yīng)于特定HBV-TCR識別表位的肽脈沖全血后，僅在2名患者接受HBV-TCR T細胞治療后而非治療前誘導(dǎo)了Th1細胞因子的分泌。分泌的細胞因子量也顯示出與輸注劑量相關(guān)的依賴性。這些發(fā)現(xiàn)支持使用全血細胞因子釋放檢測來監(jiān)測自體移植后經(jīng)工程改造的T細胞制品在體內(nèi)的功能和數(shù)量的有效性。

T細胞經(jīng)過工程改造以表達外源性CAR或TCR的療法的臨床療效已與其在體內(nèi)的增殖和持久能力相關(guān)聯(lián)。因此，用于測量過繼性T細胞治療療效的生物分析平臺主要開發(fā)用于檢測治療患者外周血中工程改造T細胞的存在，基本上忽視了過繼轉(zhuǎn)移后這些T細胞在體內(nèi)的效應(yīng)功能分析。這種忽視可能會產(chǎn)生重要影響，因為效應(yīng)T細胞的功能，如細胞因子的產(chǎn)生，可能因反復(fù)的抗原刺激或與免疫微環(huán)境的相互作用而改變，其中過繼轉(zhuǎn)移的T細胞識別其抗原。這一點在那些在具有T細胞耐受特性的器官（如肝臟）中發(fā)揮效應(yīng)功能的T細胞中尤為明顯。

此外，雖然大多數(shù)CAR-和TCR-T細胞是通過使用病毒載體方法進行改造的，以實現(xiàn)引入的轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性表達，但也有一些替代方法使用體外轉(zhuǎn)錄的mRNA提供非整合性和暫時性的T細胞修飾。在這些情況下，mRNA的不穩(wěn)定性質(zhì)和CAR或TCR的短暫表達使得無法有意義地監(jiān)測這些T細胞在體內(nèi)的持久性。使用mRNA改造的T細胞治療反而需要評估這些功能性短暫的工程T細胞在體內(nèi)的即時功能，以理解其與治療效果的關(guān)系。

因此，縱向評估工程T細胞在轉(zhuǎn)移給患者前后的功能非常重要。雖然之前已經(jīng)證明可以在體外通過全血評估工程TCR T細胞的細胞毒性，但理想情況下，監(jiān)測過繼轉(zhuǎn)移的工程T細胞的功能應(yīng)采用簡單的檢測方法，不需要大量的血液或復(fù)雜的程序。

這里通過改進開發(fā)的一種SARS-CoV-2快速全血T細胞檢測方法來實現(xiàn)這一目標(biāo)。在該檢測中，SARS-CoV-2肽直接添加到少量肝素化全血（320μL）中，以刺激SARS-CoV-2特異性T細胞。由于肽刺激釋放到血漿中的IFN-γ和IL-2的量與循環(huán)的功能性SARS-CoV-2特異性T細胞的頻率成正比。假設(shè)通過將含有特定TCR T細胞識別的T細胞表位的肽直接加入接受過繼T細胞治療的患者的全血中，可以測量工程化TCR T細胞的體外功能。

為了說明該檢測方法的實用性，這里使用這種方法縱向監(jiān)測了2名原發(fā)性HBV-HCC患者體內(nèi)接受過HBV特異性TCR工程T細胞過繼轉(zhuǎn)移后的功能，此前已經(jīng)證明這種治療方法對HBV-HCC具有治療潛力。

結(jié)果

招募了2名不適合或?qū)ΤＲ?guī)治療無效的HBV-HCC患者，并用自體mRNA工程改造的HBV-TCR T細胞進行多次輸注治療，之前已經(jīng)證明這種方法對HBV-HCC具有治療潛力并已在公布在專利CN115335397A。自體HBV-TCR T細胞是通過白細胞分離術(shù)獲得的PBMCs經(jīng)mRNA電穿孔技術(shù)改造，并以適當(dāng)?shù)臄?shù)量冷凍保存用于輸注。由于HBV-TCR T細胞在慢性HBV感染背景下能夠介導(dǎo)針對HBV-HCC患者的靶向腫瘤外裂解HBV感染的肝細胞，因此實施了劑量遞增輸注方案，在這里僅顯示前四次遞增劑量（1×10^5、1×10^6、3-5×10^6和3-5×10^6 TCR+ T細胞/千克體重）的輸注，每隔14天進行一次（圖1）。在每次輸注前后指定時間點收集少量肝素化的外周全血（約1mL），從1×10^6 TCR+ T細胞/千克體重劑量開始，在輸注后3h收集樣本，并對血液進行未刺激或用包含相應(yīng)HBV表位的HBV肽刺激。經(jīng)過一夜孵育后，收集約100μL血漿并分析細胞因子（IFN-γ、IL-2、GzB、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13 和 IL-10）的產(chǎn)生。

細胞因子（特別是 IFN-γ、IL-2 和 GzB）在2名患者中僅在啟動mRNA HBV-TCR T細胞治療后（3h）可明顯檢測到，在此之前則未檢測到，這表明HBV-TCR T細胞的輸注與肽特異性細胞因子反應(yīng)的增加有關(guān)。分泌的細胞因子主要為Th1類型，而Th2類型細胞因子和IL-10則未被檢測到。當(dāng)用相應(yīng)肽刺激添加了自體 mRNA HBV-TCR T 細胞的健康供者肝素化全血并以相同方式分析時，觀察到的情況與此類似。mRNA 工程改造的HBV-TCR T細胞輸注后3h收集的肽脈沖血液樣本中 IFN-γ、IL-2 和 GzB 的數(shù)量與輸注的HBV-TCR T細胞數(shù)量完全成正比。在輸注1×10^6 TCR+ T細胞/kg時，三種細胞因子在較低數(shù)量（<35 pg/ml）下即可被輕松檢測到，并且在輸注3×10^6和5×10^6 TCR+ T細胞/kg后數(shù)量更高。反映mRNA工程改造的 HBV-TCR T細胞的瞬時TCR 表達（72 h后約有10%的TCR表達），IFN-γ和IL-2的數(shù)量在輸注后3天內(nèi)迅速下降，并在7天內(nèi)恢復(fù)到基線水平。將2名患者的IFN-γ分泌量與健康供者進行比較，估計從2名患者中檢測到的大HBV-TCR T細胞數(shù)量約為每毫升全血2500至12000個T細胞。

評估過繼轉(zhuǎn)移的HBV-TCR T細胞在體內(nèi)的功能?；颊?（A）和患者2（B）在接受HBV-TCR T細胞輸注（第二次、第三次和第四次輸注）后的不同時間點，經(jīng)肽刺激后血漿中細胞因子的濃度。2名HBV-HCC患者的肽誘導(dǎo)IFN-γ（C）和IL-2（D）分泌的縱向監(jiān)測。肽刺激后血漿中細胞因子的濃度（為清晰起見，顯示了輸注后3h的數(shù)據(jù)）以及未刺激的含DMSO陰性對照孔（灰色）的背景數(shù)據(jù)。將320μL新鮮采集的肝素化血液或含有自體mRNA工程HBV-TCR T細胞的肝素化血液與80μLRPMI混合，并用含表位的肽（Pt. 1：來自HBV包膜的10mer，HLA-A24限制；Pt. 2：來自HBV包膜的9mer，HLA-A2限制）或DMSO作為對照刺激，濃度為2μg/mL。孵育16h后，將進行肝素化全血的血漿分離。為了確保大限度地回收血漿，樣品在室溫下以700 rcf（相對離心力）離心10min。收集約100μL血漿并儲存在-80°C。為了定量收集的血漿中細胞因子的含量，首先解凍冷凍血漿，并根據(jù)制造商的協(xié)議（Protein Simple）使用基于微流控ELISA的ELLA系統(tǒng)分析細胞因子濃度。除非另有說明，否則從數(shù)據(jù)中減去了未刺激的含DMSO陰性對照孔的背景細胞因子值。

體外細胞因子分泌譜分析顯示mRNA工程HBV-TCR T細胞的特點。從2名健康供者獲得的PBMCs中制備的指定數(shù)量的HBV-TCR T細胞被加入到320μL的自體全血中。在全血經(jīng)過一夜的肽刺激后，使用Protein Simple ELLA平臺分析了血漿中釋放的細胞因子濃度。

總結(jié)

這里使用了已知會隨著時間（約72h）喪失TCR特異性功能的mRNA工程T細胞，成功實施了一種劑量遞增輸注方案，并通過全血檢測證明了：①T細胞特異性細胞因子分泌的動力學(xué)與輸注的mRNA工程T細胞的時間受限功能一致；②細胞因子分泌水平與輸注的TCR T細胞劑量相關(guān)；③在每公斤體重輸注1×10^6 TCR T細胞后檢測到細胞因子分泌。

快速全血T細胞檢測有多個特點，使其比傳統(tǒng)方法更適合監(jiān)測過繼轉(zhuǎn)移后工程T細胞的存在和功能。首先，與ELISPOT或流式細胞術(shù)等傳統(tǒng)技術(shù)不同，它不需要預(yù)先從血液中分離PBMCs。該檢測還具有在全外周血這一自然環(huán)境中評估工程T細胞功能的優(yōu)勢，無需添加會改變可溶性因子環(huán)境的蛋白運輸抑制劑，這是成功檢測胞內(nèi)細胞因子所必需的步驟。重要的是，已經(jīng)證明，通過修改刺激肽，可以輕松調(diào)整該檢測以檢測其他特異性的T細胞。雖然理論上可以使用該檢測來監(jiān)測CAR-T細胞甚至腫瘤浸潤淋巴細胞，只要知道T細胞的特異性信息，但尚不清楚如果使用全長抗原而不是短肽，檢測性能是否會受到影響。

總的來說，這種簡單的檢測方法非常適合監(jiān)測患者外周血中不同TCR T細胞產(chǎn)品的功能，包括常用的高度穩(wěn)定的TCR/CAR表達T細胞，這些T細胞的輸入劑量通常較高，范圍在每公斤體重10^6到10^8之間。這些穩(wěn)定T細胞產(chǎn)品的功能追蹤可能會揭示腫瘤靶標(biāo)或其微環(huán)境隨時間引起的耗竭/抑制情況，提供有關(guān)其功能動力學(xué)及其與治療效果關(guān)聯(lián)的重要信息，而目前這方面的評估在很大程度上仍未被探索。