腦梗塞大鼠腦組織水腫與腦脊液ApoE多態(tài)性關(guān)系

　   作者：馬萍 作者單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)基礎(chǔ)部解剖教研室，黑龍江 大慶市 163319

　　【摘要】 目的：探討腦梗塞大鼠腦脊液載脂蛋自E(ApoE)基因多態(tài)性與周圍腦組織水腫的關(guān)系。方法：對ApoE基因擴增DNA，進(jìn)行AfI Ⅲ和Hae Ⅱ雙酶切技術(shù)，檢測16例腦梗塞大鼠ApoE基因型頻率，根據(jù)腦梗塞大鼠標(biāo)本切片計算腦水腫指數(shù)，統(tǒng)計學(xué)分析它們之間的關(guān)系。結(jié)果：腦水腫指數(shù)與ApoE3呈負(fù)相關(guān)，而與ApoE4呈正相關(guān)，兩者都具有統(tǒng)計學(xué)意義，腦梗塞大鼠腦脊液ApoE3和ApoE4與周圍腦組織水腫具有相關(guān)性。 結(jié)論：腦梗塞大鼠腦脊液ApoE多態(tài)性可能是影響周圍腦組織水腫的因素之一。

　　【關(guān)鍵詞】 腦梗塞,腦水腫,載脂蛋自E類

　　Abstract：ob[x]jective:To study the relationship between cerebrospinal fluids apolipoprotein E(ApoE) polymorphism and brain edema in rats with cerebral infarction.Methods:The cerebrospinal fluids ApoE genetic polymorphism was analyzed by PCR and AfI Ⅲ and Hae Ⅱ double enzyme digestion.The edema index was estimated by pathological methods in 16 rats with cerebral infarction.The relationship between cerebrospinal fluids apolipoprotein E(ApoE) polymorphism and brain edema was analyzed by statistic software.Results:There was negative correlation between brain edema index and ApoE3(r=-0.434,P<0.05) and positive correlation between brain edema and ApoE4(r=0.415,P<0.05).Conclusion:The cerebrospinal fluids ApoE polymorphism may be one of the factors affecting the brain edema in rats with cerebral infarction.

　　Author′s　address：Department of Found,Daqing Part,Haerbin Medical University,Daqing,Heilongjiang,163319,China

　　Key words：Cerebral infarction;Brain edema;Cerebrospinal fluid;Apolipoprotein E category

　　腦梗塞(cerebral infarction,CI)的發(fā)病率、病死率和致殘率都較高，是危害人類生命健康的主要疾病，近年來其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。急性期腦水腫是導(dǎo)致病情加重的主要原因，控制繼續(xù)損傷和減輕腦水腫是治療腦梗塞的關(guān)鍵。但水腫的發(fā)生和發(fā)展機制目前仍不清楚。探討腦水腫規(guī)律及其機制，對臨床上治療和控制病情的進(jìn)展至關(guān)重要。目前有文獻(xiàn)報道認(rèn)為載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因在顱腦損傷后起著重要的作用[1,2]，并具有多態(tài)性，且各基因型具有不同的功能，為此，本研究應(yīng)用大腦中動脈栓線技術(shù)，建立腦梗死大鼠模型，觀察其是否與腦水腫的發(fā)生有相關(guān)性。

　　1 資料與方法

　　1.1 實驗動物

　　成年雄性Wistar大鼠40只，體重250～300 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號:黑動字第P00102008號，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和飲用純凈水，處于恒溫(20～25℃)。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 模型制作：(1)栓線處理:選用直徑為0.20～0.25 mm的強力釣魚線，剪成長為40mm的栓線，線前端經(jīng)灑精燈處理成光滑球型，在手術(shù)顯微鏡下觀察其光滑程度，不合格的剔除，合格的栓線消毒后放入生理鹽水中備用;(2)造模:在室溫22℃條件下，大鼠稱重后，用200g/L氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(1.0～1.2g/kg)，將大鼠仰臥固定在實驗手術(shù)臺上。頸部備皮、常規(guī)消毒后，行正中切口，沿雙側(cè)頜下腺中間剪開淺筋膜，鈍性分離右側(cè)胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌之間的肌間隙，暴露頸總動脈和迷走神經(jīng)。鈍性分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈近心端，并于頸總動脈遠(yuǎn)心端備線，頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端用微動脈夾夾閉，參考Zea-Longa方法[3]，于頸總動脈近分叉處切口,插入相應(yīng)直徑的栓線，收緊備線，打開動脈夾，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動脈，插入方向稍向外側(cè)，以防進(jìn)入翼腭動脈，當(dāng)栓線進(jìn)入15～19mm時，可感到手下有阻力感，證明栓線頭端已達(dá)大腦中動脈處，進(jìn)線至大腦前動脈近端，阻斷大腦中動脈的所有血液來源，扎緊備線，固定纖維，縫合，切口局部撒消炎粉，術(shù)后動物注意保溫。

　　1.2.2 神經(jīng)癥狀的觀察與測定：造模大鼠30只，死亡9只，腦梗塞大鼠模型21只，待大鼠清醒后，按Bederson[4]評分法判斷模型制作是否成功。Ⅰ級：將大鼠尾巴提起.癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展;Ⅱ級：除Ⅰ級體征外，向癱瘓側(cè)推大鼠時阻力較健側(cè)明顯減低;Ⅲ級：除以上體征外，大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。其中符合標(biāo)準(zhǔn)的有16只。

　　1.2.3 標(biāo)本制備及腦水腫指數(shù)測定：腦脊液標(biāo)本制備：腦損傷血腫周圍基底節(jié)、血腫側(cè)皮質(zhì)腦組織含水量72 h明顯增加[5]，見圖2。在實驗72h后,以10%水合氯醛麻醉(350mg/kg)大鼠，從寰枕膜處收集腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)100μl，造模72h后處死大鼠，立即取腦，于-20℃冰箱中冰凍約10 min，取出，沿冠狀切成約2mm厚的腦片，置于2%的氯化四唑(TTC)中，37℃恒溫水浴箱中顯色10min后取出腦片，用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計算梗塞面積(S1)及包括周圍水腫范圍的大面積(S2)，腦水腫指數(shù)EI=(S2-S1)/S1

　　圖1 正常腦組織(略)

　　圖2 梗塞3d周圍細(xì)胞明顯水腫(略)

　　1.2.4 ApoE基因雙酶切多態(tài)性分析

　　取腦脊液100μl用蛋白酶K消化，按標(biāo)準(zhǔn)酚、氯仿、異戊醇法提取DNA，由Beack|man紫外/可見光核酸分析儀測DNA濃度;上海生物工程技術(shù)有限公司合成的一對引物，序列為P1:5′-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCCCA-3′，P2:5′-GCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3′，反應(yīng)條件為：按94℃變性30s,55℃退火30s,70℃延伸90s，進(jìn)行40個循環(huán)。在消毒滅菌的反應(yīng)管內(nèi)依次加入25μl擴增產(chǎn)物，5μ1的10×緩沖液含2.5 U的限制性內(nèi)切酶AfI Ⅲ和Hae Ⅱ 5 U，混合均勻，置37℃水浴消化2h，-4℃終止消化。酶切后的產(chǎn)物用4%瓊脂糖(promega公司用于小片段分離)電泳,80V電壓電泳2 h,溴化乙錠(EB)染色,紫外燈下分析酶切產(chǎn)物(見圖3)。

　　圖3 ApoE基因Hae Ⅱ酶切片段電泳圖譜(略)

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

　　采用頻率計數(shù)法計算ApoE各等位基因頻率，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計量資料用t檢驗，等位基因頻率的差異用x2檢驗，使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，用Spcarman相關(guān)系數(shù)分別檢驗?zāi)X水腫指數(shù)與ApoE3及ApoE4的相關(guān)關(guān)系。

　　2 結(jié)果

　　見表1。隨著ApoE3的增高，腦水腫指數(shù)有下降趨勢，而隨著ApoE4的增高，腦水腫指數(shù)則有升高趨勢，統(tǒng)計學(xué)分析顯示“腦水腫指數(shù)與ApoE3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.434,P<0.05)，見圖4;而腦水腫指數(shù)與ApoE4呈正相關(guān)(r=0.415,P<0.05)，見圖5。

　　表1 各組大鼠腦脊液中ApoE表達(dá)值(略)

　　注：與正常組比較△△P<0.01。

　　圖4 腦水腫指數(shù)(略)

　　圖5 腦水腫指數(shù)(略)

　　3 討論

　　ApoE基因共有3個等位基因分別為ε2,ε3和ε4，并由此產(chǎn)生6種基因型[6]即ApoE2/2,E3/3,E4/4三種純合子型和ApoE2/3,E2/4,E3/4三種雜合子型。ε3,ApoE3/3分別是常見的等位基因和基因型，其基因頻率為77%，ε2基因頻率為8%，ε4基因頻率為15%。由于ApoE多態(tài)性具有重要的生物學(xué)特性，所以對ApoE多態(tài)性的實驗研究對臨床具有重要指導(dǎo)意義。

　　腦脊液中的ApoE由腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞合成，濃度約為血漿中的1/10，是腦脊液中的主要載脂蛋白，且具有獨立的調(diào)節(jié)機制，主要通過與LDL受體相關(guān)蛋白或LDL及相關(guān)的VLDL受體結(jié)合機制進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞[7]。大量文獻(xiàn)報道腦脊液ApoE在顱腦外傷后有腦保護(hù)作用，并且腦脊液中ApoE濃度與患者病情及預(yù)后密切相關(guān)。盡管損傷后血漿中ApoE可能滲漏到腦脊液中，但腦脊液中ApoE濃度仍然降低，可能的原因是損傷后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性合成減少或ApoE代謝加快[8]。近來的研究表明，由于ApoE的多態(tài)性各等位基因在腦中有不同甚至相反的生物功能[9]。有人在啟動子控制下制作了ApoE3或ApoE4轉(zhuǎn)基因鼠，轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)歷了60min的大腦中動脈堵塞，在恢復(fù)血供24h后，檢測發(fā)現(xiàn)ApoE組梗塞灶較小，且ApoE3組偏癱發(fā)生較輕，提示ApoE3與ApoE4可能存在不同的作用[10]。

　　Lynch等[11]研究表明ApoE與顱腦損傷后腦水腫有關(guān)。他們認(rèn)為這可能因為ApoE可減輕組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)及保護(hù)血腦屏障，但未對其多態(tài)性做進(jìn)一步分析。本研究根據(jù)實驗大鼠腦切片計算腦水腫指數(shù)，結(jié)果顯示腦水腫指數(shù)與ApoE3負(fù)相關(guān)，而與ApoE4正相關(guān)，兩者都具有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示腦脊液ApoE3和ApoE4與周圍腦組織水腫程度存在密切關(guān)系，且二者可能具有相反的生理功能。

　　腦梗塞是常見的疾病，容易發(fā)生腦水腫，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，進(jìn)而造成繼發(fā)性腦損傷，患者殘死率高[12]。因此，預(yù)防和控制腦水腫已成為腦梗塞治療的關(guān)鍵問題。許多學(xué)者對ApoE基因治療顱腦損傷給予了很高的期望，體內(nèi)外實驗均已證實轉(zhuǎn)入ApoE3基因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[13]。鑒于ApoE3基因在減輕腦水腫中的積極作用，我們認(rèn)為利用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，向腦室內(nèi)或腦組織局部注射外源性ApoE3基因可能對提高顱腦損傷患者的臨床療效有一定幫助。