CXCR4/CXCL12在肺癌轉(zhuǎn)移中的初步研究

作者：石新云,童永清,孫小軍　　作者單位：312000 浙江省紹興市第六醫(yī)院呼吸內(nèi)科(石新云 孫小軍)中南大學腫瘤研究所(童永清)

　 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個具有高度組織性和器官選擇性的復雜連續(xù)過程， 雖然已證明很多因素參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，但是不同組織來源的腫瘤細胞遷移、侵襲到特定部位的分子機制還不清楚。趨化因子是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子，具有調(diào)節(jié)各種類型的白細胞遷移、吸引具有特定的趨化因子受體的炎癥細胞浸潤到炎癥部位參與炎癥反應(yīng)的作用。 不同組織類型的腫瘤細胞常見的轉(zhuǎn)移部位不同,趨化因子及受體是否如趨化炎癥細胞的定向移動一樣來參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的定向遷移與轉(zhuǎn)移成為目前研究的熱點。近來的研究表明，趨化因子受體及配體與腫瘤細胞的定向遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[1，2]。為探索趨化因子受體及配體CXCR4/CXCL12 在肺癌細胞遷移中的作用，作者檢測肺癌組織、肺癌細胞系A(chǔ)549、血管內(nèi)皮細胞系VEC 中趨化因子受體CXCR4 以及肺癌患者胸水與淋巴組織中趨化因子CXCL12 的表達，并對其趨化活性進行相應(yīng)分析，以期為趨化因子受體及配體CXCR4/CXCL12 誘導肺癌細胞的定向遷移提供實驗依據(jù)。

　　1 資料與方法

　　1.1 研究對象

　　(1)細胞系：A549細胞株為人肺腺癌細胞株，VEC細胞株為人血管內(nèi)皮細胞株，均由中南大學腫瘤研究所保存、提供。(2)臨床標本：選取2004 年8 月至2005 年8月本院手術(shù)肺癌21例，年齡23～72歲(中位年齡51歲)，其中大細胞性肺癌12例，小細胞性肺癌7例，未分化癌2例;TNM分期I期5例 ，II期7例，III期7例，IV期2例。同期手術(shù)的良性肺部腫瘤17例作對照組，年齡31～60歲(中位年齡43歲)，取其正常肺組織(經(jīng)術(shù)后病理學檢查證實)進行實驗。

　　1.2 研究方法

　　(1)標本的采集：術(shù)中收集肺癌患者的肺癌組織，頸部淋巴結(jié)組織，支氣管平滑肌組織以及良性肺腫瘤患者切除的正常肺組織，置液氮中保存，同時收集無血液污染的上述肺癌患者的胸水置于無菌離心管，4℃保存，于4h內(nèi)檢測CXCL12 的趨化活性，或-70℃保存(檢測CXCL12的含量)。(2)肺癌患者胸水中趨化因子的檢測：CXCL12 的含量用ELISA試劑盒(Ferment公司)檢測。(3)CXCR4和CXCL12 mRNA表達水平的測定：將肺癌組織、頸部淋巴結(jié)組織、支氣管平滑肌組織及良性肺腫瘤組織在液氮中研磨為粉末狀，然后與A549、VEC細胞均用TRIzol試劑一步法提取組織/細胞中的總RNA,用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴增CXCR4和CXCL12,同時擴增GAPDH作為內(nèi)參照.CXCR4引物序列為:正義鏈5'-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3'反義鏈5'-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3';CXCL12引物序列為:正義鏈5'-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3',反義鏈5'- CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3'。CXCR4和CXCL12 產(chǎn)物的擴增長度分別為260bp和227bp。PCR反應(yīng)條件：94℃,預變性2min,然后 94℃變性60s, 56℃ 退火60s,72℃延伸60s,共30個循環(huán),后再72℃延伸10min后結(jié)束反應(yīng)。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像，并確定條帶的光密度值。整個RT-PCR過程獨立重復3 次，以3次實驗所得光密度值的平均數(shù)表示mRAN 含量。(4)Western Blot 分析：將同樣大小肺癌組織及正常肺組織勻漿，以去污劑細胞裂解液將組織勻漿及細胞裂解，參照文獻方法[3]提取蛋白。取80μg蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、溫封閉1h 后，加入0.05%Tween20的TBS 緩沖液稀釋的CXCR4兔抗人單克隆抗體(1：500)，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗(1：1000)，37℃溫育1h，增強化學發(fā)光系統(tǒng)顯色。利用投射儀圖像分析系統(tǒng)掃描確定X線片上雜交條帶的光密度值，實驗獨立重復3 次，以所得光密度值的平均數(shù)表示蛋白含量。(5)趨化活性分析：以48孔微趨化板，分別檢測重組人CXCL12和肺癌癌性胸水對CXCR4陽性細胞的趨化作用。參照文獻[4]：下室分別加入不同濃度(0.1-200ng/ml)的重組人CXCL12或肺癌癌性胸水，同時以無趨化因子的培養(yǎng)基作陰性對照，均為3復孔，上室中加入A549、VEC細胞，上下室之間鋪上10μm孔徑的PVP聚碳酸膜，于37℃含5%CO2孵箱中孵育4.5h，以PBS 棉簽拭去膜背面的細胞，70%的甲醇固定，蘇木精染色，計數(shù)至少5個視野(光鏡， 放大200倍)的細胞數(shù)。計算趨化指數(shù)CI(遷移到含有不同濃度趨化因子液體膜側(cè)的細胞數(shù)與遷移到陰性對照液膜側(cè)的細胞數(shù)的比值)，以CI的大小表示趨化活性的高低。實驗獨立重復3次。(6)圖像分析：運用德國LEICA Q550IW圖像分析儀對RT-PCR和Western Blot 結(jié)果進行圖像分析,計算條帶的積分光密度IA,IA= 平均吸光度乘號X面積,分別采用CXCR4,CXCL12 積分光密度比值表示其含量。

　　1.3 統(tǒng)計學方法

　　應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件,CXCR4、CXCL12 mRNA和蛋白表達用χ2檢驗，趨化活性比較及CXCR4 的表達與臨床病理分期相關(guān)性分析用t檢驗。

　　2 結(jié)果

　　2.1 CXCR4和CXCL12、mRNA水平的表達

　　肺癌A549細胞和血管內(nèi)皮VEC 細胞CXCR4的mRNA相對表達量分別為(2.14±1.15)和(1.72±1.20)。21例肺癌組織表達CXCR4 mRNA，其相對表達量為(2.21±1.09)，與臨床分期差異無顯著性(r=0.1，p>0.5)。17例肺組織(取自良性肺腫瘤正常肺組織)未檢測出CXCR4 mRNA的表達。肺癌患者支氣管旁、頸部淋巴結(jié)組織75%(16/20)可見CXCL12 mRNA的表達，其相對表達量為(1.14±0.87);支氣管平滑肌組織未檢測到CXCL12 mRNA的表達。

　　2.2 CXCR4蛋白的表達

　　21 例肺癌組織均可見CXCR4蛋白表達，其相對表達量為(1.51±0.12);肺癌A549細胞、血管內(nèi)皮VEC細胞CXCR4蛋白相對表達量分別為(1.76±0.25)和(1.89±0.24)。17例正常肺組織未檢測到CXCR4蛋白表達。

　　2.3 肺癌胸水中CXCL12的含量

　　18例肺癌患者胸水標本中均發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12，其含量783～8，364pg/ml(中位數(shù)為6，871pg/ml)。

　　2.4 重組CXCL12、癌性胸水誘導肺癌細胞及血管內(nèi)皮細胞的移動

　　肺癌癌性胸水可誘導肺癌癌細胞株A549的移動，其趨化指數(shù)為(1.9±0.8)。不同濃度的重組人CXCL12對肺癌癌細胞A549和血管內(nèi)皮細胞VEC的趨化活性不同，濃度為100ng/ml時趨化活性高，A549 和VEC細胞的趨化指數(shù)分別為(3.9±1.2)和(4.1±1.6)，與對照組(1.0±0.4)和(1.1±0.7)比較，P<0.05。CXCL12作用后，跨膜細胞經(jīng)蘇木精染色可見細胞與培養(yǎng)瓶中生長的細胞形態(tài)一致，而未染過的細胞基本成圓形。

　　3 討論

　　CXCL12是CXC趨化因子亞家族的成員之一，通過與趨化因子受體CXCR4結(jié)合細胞發(fā)揮趨化作用[5]。CXCL12 可誘導大多數(shù)循環(huán)淋巴細胞和CD34前體細胞的粘附與細胞表面的分泌性蛋白，如整和素相互作用，使細胞定向性遷移致特殊部位[6]。內(nèi)皮細胞表達CXCR4，且CXCL12 對之有強烈的趨化作用[7]。CXCR4和CXCL12 基因缺失的小鼠由于心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的出血而導致圍產(chǎn)期死亡[8]。其原因主要是由于CXCR4和CXCL12缺失，使胚胎前體細胞移動異常，而未能到達適當?shù)奈h(huán)境中造成的。本研究顯示，肺癌表達CXCR4，肺癌癌性胸水及人重組CXCL12均對肺癌癌細胞及血管內(nèi)皮細胞有趨化作用，表明它們的相互作用對體內(nèi)造血細胞及非造血細胞的遷移起較為重要的作用。

　　研究表明，乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等均表達有功能活性的趨化因子受體，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的遷移[9～11]。本研究顯示，肺癌癌細胞及血管內(nèi)皮細胞表達有功能活性的趨化因子受體CXCR4，與CXCL12作用后，誘發(fā)細胞與肌動蛋白聚合相關(guān)的假偽足形成、定向性遷移、侵襲和血管生成，其作用過程與癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移機制相吻合。肺癌常見的轉(zhuǎn)移方式是直接 ，其次為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。肺癌癌性胸水中CXCL12 的含量較高， 肺門淋巴結(jié)有CXCL12的表達，癌性胸水和重組CXCL12均可誘導肺癌癌細胞的遷移，這進一步說明CXCR4/CXCL12 可能在卵巢癌的轉(zhuǎn)移中起一定作用。

　　綜上所述，CXCR4/CXCL12 受體配體系統(tǒng)可介導肺癌癌細胞及血管內(nèi)皮細胞的遷移，這可能與肺癌的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。因此，研究腫瘤細胞遷移的機制、探討CXCR4在肺癌細胞遷移中的作用有助于尋找肺癌治療的分子靶點。

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