特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血淋巴細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)及白介素18的作用

作者：潘建玲,關(guān)秀茹,馬學(xué)華,何昕　　作者單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科, 大慶 163316; 　1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)診斷教研室, 哈爾濱 150001

　　【摘要】本研究探討特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者外周血淋巴細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86及其配體CD28的表達(dá)水平及白介素18的作用。應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞技術(shù)檢測34例ITP患者和34名正常人外周血淋巴細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86及其配體CD28的表達(dá)，酶聯(lián)免疫(ELISA)法測定血漿IL18。結(jié)果表明：ITP患者外周血淋巴細(xì)胞CD80、CD86表達(dá)率(4.21±2.27%, 7.19±5.16%)均明顯高于正常對照組(2.34±0.87%，4.08±1.96%，P<0.01)。ITP組血漿IL18含量為(538.31±111.33)pg/ml，正常對照組血漿IL18含量為(489.44±49.07)pg/ml。IL18含量與血小板數(shù)量呈顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.395， P<0.05)。結(jié)論： ITP患者CD80和CD86共刺激分子過度表達(dá)，患者血漿中IL18水平比正常對照組明顯升高(P<0.05)，共刺激分子CD80、CD86與ITP發(fā)病密切相關(guān)，IL18在ITP發(fā)病機(jī)理中起重要作用。

　　【關(guān)鍵詞】 特發(fā)性血小板減少性紫癜,共刺激分子,淋巴細(xì)胞　CD80　 CD86　 CD28　白介素18

　　Abstract The ob[x]jective of study was to investigate the ex[x]pressions of CD80, CD86 and its ligand CD28 on peripheral lymphocytes in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), to explore the effect of interleukin 18 (IL18) and its clinical significance in ITP. The ex[x]pressions of costimulatory molecules (CD80,CD86 and its ligand CD28)on peripheral lymphocytes from 34 ITP patients and 34 normal humans were detected by immunofluorescence and flow cytometry. The IL18 in the plasma was detected by using enzyme li[x]nked immunosorbent assay(ELISA). The results showed that the ex[x]pressions of CD80 and CD86 on peripheral lymphocytes from ITP patients were higher than that of the normal control (4.21±2.27%, 7.19±5.16% vs 2.34±0.87%，4.08±1.96%) (P<0.01); the concentration of IL18 in plasma of ITP patients was (538.31±111.33)pg/ml, but the concentration of IL18 in plasma of controls was (489.44±49.07)pg/ml. The level of IL18 negatively correlated with the platelet counts in peripheral blood (r=-0.395, P<0.05). It is concluded that the CD28/ CD80 and CD28/CD86 costimulatory molecules are overexpressed, when the IL18 level in ITP patients is obviously higher than that in normal controls. When ITP occurred, and the costimulatory molecules CD80 and CD86 are closely associated with ITP, it seems that IL18 may play an important role in ITP pathogenesis.

　　Key words idiopathic thrombocytopenic purpura; costimulatory molecule; lymphocyte; CD80; CD86; CD28; interleukin 18

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):578-58

　　特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura , ITP)是一種出血性自身免疫性疾病，該病的特點(diǎn)是患者體內(nèi)抗血小板抗體增多，血小板破壞過多而出血。其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，但確認(rèn)與免疫應(yīng)答異常有關(guān)。近研究顯示，ITP時存在著T、B淋巴細(xì)胞功能紊亂及其細(xì)胞因子異常[1]。在T、B淋巴細(xì)胞的相互作用過程中，共刺激分子(CD80、CD86、CD28)的作用是必需的。為探討ITP的發(fā)病機(jī)制，我們應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞技術(shù)檢測了ITP患者外周血淋巴細(xì)胞CD80、CD86及其配體CD28的表達(dá)，并使用ELISA法檢測了ITP患者血漿中白介素18(interleukin 18, IL18)的含量，研究共刺激分子的表達(dá)及IL18在ITP發(fā)病中的作用。

　　研究對象

　　34例ITP病人為2005年12月至2006年4月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院、黑龍江省血液病研究所及黑龍江省醫(yī)院住院確診為ITP的患者，年齡1-53歲，男15例、女19例，診斷符合張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]。急性型27例，慢性型7例，其中兒童9例，成人25例。正常對照組34名，成人正常對照者為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院體檢中心選取體檢結(jié)論正常的健康人。

　　材料

　　試劑采用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記CD28、CD80、CD86鼠抗人單克隆抗體(CD28PE、CD80PE、CD86PE)以及相應(yīng)同型對照抗體IgG1PE均為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。IL18酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒為美國BPB公司產(chǎn)品，由大連泛邦公司提供。使用Becton Dickinson公司的流式細(xì)胞儀檢測CD28、CD80、CD86陽性表達(dá)率，使用西班牙斑珀斯公司生產(chǎn)的BIOCELL 2010酶標(biāo)儀檢測IL18。

　　方法

　　采樣 空腹采集靜脈血2 ml， 用EDTAK2抗凝，待CD28、CD80、CD86測試完畢，分離血漿標(biāo)本0.5 ml置于-20℃保存。

　　共刺激分子的檢測 單克隆抗體標(biāo)記后，分別取100 μl抗凝血放入4支實(shí)驗(yàn)管和1支對照管中，實(shí)驗(yàn)管分別加20 μl CD28PE、CD80PE、CD86PE，對照管加20 μl鼠抗人IgG1PE，室溫避光孵育30分鐘，然后加入細(xì)胞裂解液2 ml混勻，靜置8分鐘，300× g離心5分鐘。棄上清，加入PBS緩沖液，混勻200×g離心5分鐘。再棄上清，每管加入250 μl鞘液，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。用前向角散射和側(cè)向角散射散點(diǎn)圖區(qū)分細(xì)胞群體，門技術(shù)圈出分析的淋巴細(xì)胞群體。每份標(biāo)本檢測20 000個細(xì)胞。計(jì)算CD28、CD80及CD86陽性細(xì)胞比例。結(jié)果采用Macos 9.2型計(jì)算機(jī)及Cell Quest Plot軟件進(jìn)行資料采集和數(shù)據(jù)分析。

　　IL18的檢測 使用ELISA法檢測血漿IL18濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 ±SD表示，利用 Microsoft Excel 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組間比較用t檢驗(yàn)。IL18含量與血小板數(shù)量之間及CD80、CD86與血小板數(shù)之間進(jìn)行相關(guān)性分析。

　　結(jié) 果

　　ITP患者與正常對照者外周血淋巴細(xì)胞共刺激分子表達(dá)率及血漿IL18含量見附表。由附表數(shù)據(jù)可見，ITP患者外周血淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)率略高于正常對照組， 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; CD80、CD86表達(dá)率均明顯高于正常對照組，提示CD28∶CD80和CD28∶CD86共刺激通路可能參與ITP的發(fā)病。進(jìn)一步對急性、慢性ITP患者共刺激分子的表達(dá)率進(jìn)行比較，急性型CD28、CD80和CD86的表達(dá)率均高于慢性組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與收集的病例少有關(guān);ITP兒童組與成人組 CD28、CD80和CD86的表達(dá)率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與兒童組的病例少有關(guān)。ITP組比對照組血漿IL18水平明顯增高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITP急性組判別與慢性組相比及兒童組與成人組相比，血漿IL18含量增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　對CD80、CD86與血小板水平之間的相關(guān)性分析表明：CD80與血小板數(shù)之間相關(guān)系數(shù)為 -0.19，兩者之間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。CD86與血小板數(shù)之間相關(guān)系數(shù)為 -0.08，兩者之間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。進(jìn)一步分析ITP患者血漿IL18含量與血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性表明，r=-0.395，P=0.02，可見IL18含量與血小板數(shù)量呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05) 。

　　討 論

　　CD28、CD80和CD86都屬于免疫球蛋白超家族成員，它們的基因高度同源， CD80和CD86與 CD28互為受/配體，T細(xì)胞表面的CD28分子與APC表面的相應(yīng)配體CD80和CD86的結(jié)合可有效提供共刺激信號(第二激活信號)，在T細(xì)胞的激活過程中起重要作用。白介素18(interleukin 18, IL18)是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞因子，初認(rèn)為IL18是γ干擾素(interferonγ, IFNγ)的誘導(dǎo)因子(interferon gamma inducing factor, IGIF)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，IL18主要由單核巨噬系統(tǒng)產(chǎn)生,不僅能誘導(dǎo)IFNγ的生成，還與自身免疫性疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系[3,4],因此我們同時也對IL18在特發(fā)性血小板減少性紫癜發(fā)病中的作用進(jìn)行了研究。

　　我們研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者的CD80、CD86表達(dá)率均明顯高于正常對照組，CD28分子與CD80和CD86的結(jié)合增強(qiáng)，提高了細(xì)胞因子的基因表達(dá)，促進(jìn)了T細(xì)胞活化;而活化的T細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子又進(jìn)一步促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的過度增殖和分化。我們同時檢測到ITP患者血漿中的IL18水平比正常對照組明顯升高，因此共刺激分子(CD80、CD86)的過度表達(dá)促進(jìn)了T細(xì)胞的活化，而Th細(xì)胞激活導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)，提高了Th1型反應(yīng)優(yōu)勢[3]，這勢必增強(qiáng)IFNγ的分泌能力，使IFNγ誘導(dǎo)因子IL18含量增加， ITP時也有其他細(xì)胞因子的異常分泌，由于抗血小板自身抗體的產(chǎn)生受Th細(xì)胞和他們產(chǎn)生的細(xì)胞因子所控制[5]，因此ITP時免疫紊亂及異常刺激誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生自身抗體，抗血小板自身抗體產(chǎn)生使血小板遭到破壞。另一方面，ITP患者IL18能增強(qiáng)Th1細(xì)胞上調(diào)功能性FasL的表達(dá)[6,7]，選擇性地增強(qiáng)FasL介導(dǎo)的Th1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，通過FasFasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。同時IL18還通過促進(jìn)FasL的表達(dá)直接增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性[8]，殺傷異常表達(dá)自身抗原的血小板，引起血小板減少，參與ITP的發(fā)病。

　　研究數(shù)據(jù)分析表明，ITP患者IL18含量與血小板數(shù)量之間呈明顯負(fù)相關(guān)，IL18含量越高，血小板數(shù)量越少，推測IL18與ITP發(fā)病程度密切相關(guān)，進(jìn)一步表明血漿IL18水平在ITP發(fā)病機(jī)制上起著重要的作用。由于ITP患者IL18水平的增高誘導(dǎo)的是以Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)為主，目前有研究顯示，穩(wěn)定緩解期的患者是Th2優(yōu)勢[9]，因此逆轉(zhuǎn)Th1/Th2類細(xì)胞極化模式是研究ITP治療的一個新方向。