分泌性白細胞蛋白酶抑制因子在創(chuàng)傷愈合中的潛在應用前景

作者：屈紀富，江德鵬
　　【摘要】 分泌性白細胞蛋白酶抑制因子(SLPI)是一種可以對抗各種絲氨酸蛋白酶活性的12kDa陽離子蛋白，其羧基末端具有抑制糜蛋白酶、胰彈性蛋白酶等方面的活性，氨基末端有抗細菌、抗真菌、抗逆轉錄病毒等多方面的活性。近來研究發(fā)現(xiàn)，SLPI可通過生長增殖、細胞凋亡、組織改建等多種途徑來調控創(chuàng)傷微環(huán)境，從而影響創(chuàng)傷愈合進程。本文就SLPI參與創(chuàng)傷愈合過程的可能環(huán)節(jié)和作用綜述如下。
　　【關鍵詞】 分泌性白細胞蛋白酶抑制因子;創(chuàng)傷愈合;增殖

　　Abstract: Secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI)is a 12kDa mucosal secretory protein that is identified as a potent inhibitor of various serine proteases.The active inhibitory sites for leukocyte proteases and elastase are located in Cterminal domain,whereas,the activities of antibacterial,antifungal and antiretrovirus are found in Nterminal domain.Recent studies suggest that SLPI modulates wound healing via the activities of proliferation,apoptosis,tissue remodelling.This review focuses on the possible approaches and functions of SLPI in the process of wound healing.

　　Key words:secretory leukocyte protease inhibitor;wound healing;proliferation

　　1 分泌性白細胞蛋白酶抑制因子(SLPI)的基本特性
　　SLPI是一個12kDa大小的陽離子蛋白，屬于內(nèi)源性免疫相關蛋白，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定。SLPI是包含107個氨基酸的單鏈多肽[1]，其羧基端結構域(也稱酸性蛋白域)含有Trappin家族所共有的蛋白酶結合區(qū)，氨基端結構域介導與肝素的結合，形成可逆復合體后發(fā)揮其抗微生物活性。人SLPI基因定位在染色體20q 1213.2，長約26kb，包括4個外顯子(exon)和3個內(nèi)含子(intron)[1]。
　　SLPI是一種由黏膜被覆上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等分泌的非糖基化蛋白，存在于各種黏膜分泌液中，包括唾液，呼吸道分泌液，胃腸道分泌液及子宮頸黏液等，在黏液中其生理濃度大約是0.1～10μg/ml[2]。創(chuàng)傷后SLPI表達顯著增加，Urso等[3]通過定量RTPCR和Western blotting方法發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后SLPI基因和蛋白表達均顯著增加;皮膚角化細胞也可表達SLPI，并且其創(chuàng)傷后表達遠較中性粒細胞量更高。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，大鼠傷口局部組織SLPI表達顯著增加，傷口液刺激可使大鼠皮膚來源的真皮多能干細胞表達SLPI顯著增加，提示SLPI在創(chuàng)傷愈合中有重要意義。鑒于SLPI具有較強的抑制血漿蛋白酶、抗細菌、抗真菌、抗病毒活性，還能夠調控生長增殖，在創(chuàng)傷過程中呈高表達，而SLPI基因缺失的動物傷口愈合明顯延遲，炎癥反應加劇，蛋白酶活性增強，基質沉積延遲[5]，提示SLPI可通過多種途徑來調控創(chuàng)傷微環(huán)境，從而影響創(chuàng)傷愈合進程。
　　2 SLPI的抗蛋白酶和抗炎活性
　　SLPI主要的作用是保護局部組織免受過度炎性反應的影響。SLPI通過抑制蛋白酶的活性來保護局部組織，包括中性粒細胞分泌的彈性蛋白酶和胰蛋白酶，胰腺細胞分泌的糜蛋白酶和胰蛋白酶，肥大細胞分泌的胃促胰酶等[8]。彈性蛋白酶的過度釋放是導致急、慢性肺部疾病的主要因素之一，慢性支氣管炎發(fā)作時，上呼吸道分泌液的SLPI濃度顯著增高，以通過抗蛋白酶作用來達到抗炎作用，以免機體發(fā)生過度炎性反應[7]。Barrios等[6]采用氣道高反應性體內(nèi)、體外模型進行研究，結果顯示SLPI可以顯著抑制胰蛋白酶介導的平滑肌高反應。內(nèi)源性SLPI對其他肺部炎性疾患如肺氣腫、囊性肺纖維化、急性呼吸窘迫綜合征等均有保護和治療作用。SLPI的抗蛋白酶活性主要在羧基末端，氨基末端沒有抗蛋白酶活性，但能夠穩(wěn)定蛋白酶-抗蛋白酶復合物。SLPI還能夠增加谷胱甘肽的水平，降低前列腺素E2和基質金屬蛋白酶的合成，減少組織的氧化損傷[7]。
　　除通過抑制蛋白酶途徑，SLPI也可以通過下調巨噬細胞對LPS的反應來保護局部組織對抗炎性產(chǎn)物，脂多糖(LPS)直接或者通過腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)1β、IL6、IL10誘導巨噬細胞釋放SLPI[8]。但SLPI反而通過保護IκB核因子κB(NFκB的抑制因子)來抑制NFκB的作用來調節(jié)炎性反應，使巨噬細胞不能釋放促炎因子和一氧化氮(NO)[8]。
　　創(chuàng)傷愈合過程中機體同樣會出現(xiàn)炎癥反應，創(chuàng)傷局部過度炎癥反應是影響部分創(chuàng)傷，特別是慢性創(chuàng)面愈合的重要因素，而SLPI具有抗炎和抗蛋白酶活性，因此，對創(chuàng)傷愈合具有重要意義[5]。
　　3 SLPI的抗細菌和抗真菌活力

　　為了檢測絕經(jīng)前后婦女子宮內(nèi)膜分泌液中抗菌因子的活性，有作者[9]觀察發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前婦女增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜分泌液可以殺死金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，而絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜分泌液無抗菌活性，進一步研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前子宮內(nèi)膜分泌液中SLPI的濃度顯著高于絕經(jīng)后，而給予SLPI抗體能夠顯著降低絕經(jīng)前子宮內(nèi)膜分泌液的抗菌活性。體外研究結果表明[10]，子宮內(nèi)膜上皮細胞株HEC1A不分泌SLPI，無抗菌活性，而HEC1B可以分泌SLPI和另一個抑制細菌生長的因子，則具有抗菌活性，提示SLPI有廣譜的抗細菌活性。氨基末端是SLPI抗菌的活性區(qū)域，SLPI的抗菌活性包括SLPI結合到細菌的mRNA和DNA上，并與SLPI的氨基末端構象的改變有關。
　　另外，SLPI還具有較廣譜的抗真菌活性，能夠對抗煙曲菌和白色假絲酵母菌。重組SLPI能部分抑制真菌蛋白酶活性，并在體外氣道上皮細胞中抑制繼發(fā)的炎性反應。SLPI上調可以對抗真菌感染，但正常情況下，SLPI的分泌量有限，當口腔防線被突破時，真菌感染隨之而來，所以唾液中SLPI上升可以提示口腔真菌感染[11]，有研究提示在人免疫缺陷病毒感染的患者中，唾液中SLPI濃度升高(>2.1ug/ml)對口腔念珠菌感染有預警作用。另外，唾液SLPI的濃度隨年齡上升而減少，因此，老年人口腔真菌感染的風險相對較高。
　　4 SLPI的調控生長增殖作用
　　很多研究結果[12,13]均提示SLPI在調控生長增殖方面具有明確的作用。多種腫瘤細胞，如上皮癌細胞，人子宮內(nèi)膜，卵巢，呼吸道和神經(jīng)組織的腫瘤和肉瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)SLPI的高表達;SLPI也能夠在體外支持無血清環(huán)境中造血干細胞的生長，加入SLPI中和抗體后這種效應消失;SLPI和子宮血漿纖維溶酶/胰島素抑制因子(uterine plasmin/trypsin inhibitor，UPTI) 能夠促進豬腺上皮細胞生長增殖，而且兩者有協(xié)同作用，這種作用可以被肝磷脂(能增強SLPI的抗蛋白酶活性)增強，而使用SLPI抗體后，SLPI的促增殖效應消失。Lai等[12]研究發(fā)現(xiàn)SLPI能促進角化細胞的生長增殖，其表達同角化細胞生長的速率正相關，表皮生長因子能夠促進SLPI的表達。另外，Devoogdt等[13]發(fā)現(xiàn)在增殖較快的3LLSsc細胞中SLPI表達升高，將SLPI轉染入增殖較慢的3LLS細胞中，能夠明顯加速細胞的生長增殖。這些研究結果提示，SLPI可能同生長增殖相關。
　　SLPI具有明確的促生長增殖作用，但其作用機制仍未完全闡明。有作者[14]推測其可能與SLPI的抗蛋白酶活性有關，但更多研究[15]提示SLPI調控生長增殖可能同抗蛋白酶活性無關。SLPI能夠促進cyclinD1的表達，細胞表達SLPI水平同轉化生長因子(TGF1)，胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)的表達呈負相關。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SLPI對真皮多能干細胞有同樣具有促增殖作用，并呈劑量依賴關系;通過氚標記胸腺嘧啶核苷([H3]Thymidine)摻入實驗發(fā)現(xiàn)，加入SLPI后，真皮多能干細胞有絲分裂明顯增強;逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)結果顯示，在SLPI誘導下，真皮多能干細胞細胞周期素依賴性激酶(cdk2)表達增強，而cyclinA和cdk4表達沒有明顯變化，Western免疫印跡結果發(fā)現(xiàn)，SLPI因子刺激后cyclinD1、cyclinE表達均明顯增強[16]，提示SLPI促進真皮多能干細胞增殖的機制可能是通過調節(jié)cyclinD1，cyclinE，cdk2等細胞周期素的表達來實現(xiàn)的。也有研究表明[17]SLPI調控生長增殖可能同MARK信號通路有關。當然，SLPI調控生長增殖的途徑和信號通路極為復雜，在不同生理和病理狀態(tài)下也不完全相同，其分子機制仍有待于進一步研究。
　　5 SLPI參與創(chuàng)傷愈合的其他作用
　　SLPI除參與細胞增殖調控外，與細胞凋亡也相關。Simpkins等[18]研究發(fā)現(xiàn)，SLPI過表達可形成一種促進細胞存活的環(huán)境，使細胞凋亡減少，而給予SLPI中和抗體和SLPI miRNA則可以誘使細胞凋亡增加，提示SLPI可能通過增殖、凋亡等與細胞生長密切相關的環(huán)節(jié)促進創(chuàng)傷修復過程。另外，SLPI也參與了創(chuàng)傷修復過程中的組織改建和細胞外基質沉積等過程。Angelov等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SLPI基因缺失的動物創(chuàng)傷后細胞外基質沉積明顯減少，與其降解相關的基質金屬蛋白酶(MMP)表達則明顯增強，體外實驗同樣證實了SLPI可以減少膠原等細胞外基質含量的表達。SLPI也可通過抑制膠原收縮作用來參與創(chuàng)傷后的無瘢痕愈合。因為膠原過度收縮是創(chuàng)傷后瘢痕形成的重要因素，SLPI基因轉染則可以抑制膠原的收縮，而給予SLPI的中和抗體則可以消除其作用;因此，SLPI不僅參與創(chuàng)傷修復過程，而且也與瘢痕形成密切相關。
　　6 小結

　　創(chuàng)傷愈合是一個涉及多種細胞因子、組織修復細胞和細胞外基質的復雜活動，包括炎癥反應、組織細胞增殖(肉芽組織形成)、組織改建等過程。SLPI具有抑制蛋白酶、抗炎、抗細菌、抗真菌、調控生長增殖及組織改建等多方面的活性，它在炎癥感染控制、細胞生長增殖等與組織修復和創(chuàng)傷愈合密切相關的領域有廣闊的研究和應用前景，但其作用環(huán)節(jié)及相關分子機制仍有待于深入研究。
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