從血液中探索更多的可能性—ctDNA NGS臨床實(shí)踐專家共識(shí)

腫瘤的基因檢測(cè)中，不少項(xiàng)目的金標(biāo)準(zhǔn)都要依托組織樣本，例如PD-L1蛋白表達(dá)，HER2的擴(kuò)增等。但對(duì)于有些患者而言，想要做相關(guān)的檢測(cè)卻會(huì)面臨無(wú)組織可取或組織樣本不夠的局面，在有限的選擇情況下，液體活檢尤其是ctDNA的高通量測(cè)序逐步發(fā)展填補(bǔ)了這塊的檢測(cè)空缺，給不少有檢測(cè)需求的患者尤其是晚期患者帶來(lái)更多希望。

2022年6月份，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)發(fā)布了《ctDNA高通量測(cè)序臨 床實(shí) 踐 專家共識(shí)（2022 年版）》，文章就ctDNA概述，ctDNA NGS檢測(cè)的臨床應(yīng)用，ctDNA NGS檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)形成7條專家共識(shí)，以供臨床和檢測(cè)進(jìn)行參考。

ctDNA（circulating tumor DNA）的來(lái)源有主要由三種途徑：細(xì)胞凋亡，細(xì)胞壞死以及活躍的細(xì)胞分泌活動(dòng)產(chǎn)生，當(dāng)這些DNA從腫瘤進(jìn)入到血液循環(huán)系統(tǒng)后便可通過(guò)外周血從采集到進(jìn)行檢測(cè)。這些游離的DNA片段長(zhǎng)度一般在132~145bp之間，并且半衰期較短（一般<2h），并且會(huì)有大量的其他來(lái)源DNA干擾，如其他正常細(xì)胞或白細(xì)胞來(lái)源的DNA，與ctDNA一起被稱為游離DNA（cell free DNA，cfDNA）。

與組織學(xué)檢測(cè)相比，ctDNA檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)，可反復(fù)取材，收集、處理和分析報(bào)告周轉(zhuǎn)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)能克服腫瘤空間異質(zhì)性，可相對(duì)全面地實(shí)時(shí)反映患者的腫瘤分子特征。 與單獨(dú)組織活檢相比，血漿ctDNA還可增加驅(qū)動(dòng)基因突變檢出率。 利用ctDNA的優(yōu)勢(shì)，臨床上可展開(kāi)多種應(yīng)用。

應(yīng)用場(chǎng)景

1.伴隨診斷：目前已有臨床證據(jù)支持ctDNA NGS檢測(cè)可應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期實(shí)體腫瘤的伴隨診斷，但涉及的驅(qū)動(dòng)基因及其變異類型與相應(yīng)分析體系均有嚴(yán)格限定，若超適應(yīng)癥應(yīng)用時(shí)，建議與患者就檢測(cè)必要性、檢測(cè)費(fèi)用以及局限性等內(nèi)容進(jìn)行充分知情。ctDNA NGS檢測(cè)已被國(guó)內(nèi)外專家共識(shí)或指南建議作為多種晚期惡性腫瘤組織基因檢測(cè)的替代方式，但依據(jù)其分析結(jié)果實(shí)時(shí)制定臨床治療策略時(shí)仍需循證證據(jù)支持。（共識(shí)2）

2.腫瘤治療療效評(píng)估及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層：晚期實(shí)體腫瘤分子靶向或免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療開(kāi)始后，基于NGS檢測(cè)的ctDNA水平定量和動(dòng)態(tài)變化分析，有望成為新興的療效評(píng)估途徑。ctDNA MRD 檢測(cè)是全新的個(gè)性化技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尚難以建立通用性技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，亟待通過(guò)大樣本、多中心、前瞻性的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其臨床效用。ctDNA NGS檢測(cè)在臨床上用于靶向或免疫治療評(píng)估和分層時(shí)，建議就檢測(cè)價(jià)值、局限性和費(fèi)用等進(jìn)行充分知情。（共識(shí)3）

3.用于腫瘤獲得性耐藥機(jī)制分析：在臨床環(huán)境中，ctDNA NGS檢測(cè)可用于識(shí)別分子靶向治療的耐藥機(jī)制，尤其對(duì)于疑難復(fù)雜的腫瘤患者，該結(jié)果有助于后續(xù)的治療選擇決策。免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療獲得性耐藥機(jī)制復(fù)雜，治療選擇壓力下的腫瘤亞克隆演進(jìn)僅為其部分原因，ctDNA靶向測(cè)序、全外顯子和（或）全基因組檢測(cè)僅作為其轉(zhuǎn)化研究工具之一。（共識(shí)4）

雖然ctDNA的NGS檢測(cè)具有多種優(yōu)勢(shì)和多樣的臨床應(yīng)用，但相比于組織檢，ctDNA的檢測(cè)的條件更為苛刻并且對(duì)產(chǎn)品的性能有更高的要求。在“共識(shí)1”中也指出，：ctDNA作為腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌或腫瘤細(xì)胞在凋亡或壞死過(guò)程中釋放入循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段，其豐度受多種因素影響，波動(dòng)較大，在內(nèi)外因素特別是治療壓力下，其攜帶的生物信息可能會(huì)發(fā)生演變，且受正常細(xì)胞胚系變異或克隆性造血細(xì)胞體系突變干擾，在臨床檢測(cè)和報(bào)告解讀過(guò)程中應(yīng)特別注意。 因此圍繞ctDNA的NGS檢測(cè)，也有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)供各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室參考執(zhí)行。包括對(duì)實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)地耗材，實(shí)驗(yàn)室體系構(gòu)建，樣本采集、處理原則，NGS檢測(cè)技術(shù)要點(diǎn)，生信方法，報(bào)告要求均有一定的標(biāo)準(zhǔn)用于規(guī)范項(xiàng)目的執(zhí)行。圍繞這些標(biāo)準(zhǔn)有以下三點(diǎn)共識(shí)： ctDNA NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理需貫穿全程，ctDNA收集、樣本處理和自動(dòng)化過(guò)程應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)化和臨床驗(yàn)證程序進(jìn)行，大程度防范因操作差異而引發(fā)的假陰性可能。樣本采集建議采用含細(xì)胞穩(wěn)定劑的抗凝管，盡快完成血漿分離，提取的cfDNA建議在24 h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，否則，置于-30 ℃至-15 ℃下儲(chǔ)存并避免反復(fù)凍融。（共識(shí)5）

ctDNA NGS檢測(cè)應(yīng)根據(jù)項(xiàng)目需求選擇技術(shù)路線，可依據(jù)檢測(cè)基因數(shù)量及覆蓋范圍大小選擇不同測(cè)序策略。 在進(jìn)行基于ctDNA的超高靈敏度突變檢測(cè)時(shí)，建議使用分子標(biāo)簽技術(shù)和優(yōu)化對(duì)應(yīng)的生物信息分析設(shè)置，以降低由于測(cè)序平臺(tái)隨機(jī)誤差導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果； 建議通過(guò)建立測(cè)序噪音和克隆性造血背景庫(kù)的方法降低克隆性造血及背景噪音帶來(lái)的影響。 （共識(shí)6）

ctDNA NGS臨床檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包含受檢者基本信息、樣本信息、實(shí)驗(yàn)室信息、檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè) 結(jié)果及變異解讀、檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果、檢測(cè)局限性及不確定性以及進(jìn)一步檢測(cè)的建議等內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立報(bào)告SOP，建議根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)、共識(shí)指南、臨床試驗(yàn)證據(jù)和實(shí)踐對(duì)檢出的腫瘤基因突變進(jìn)行分類或分級(jí)報(bào)告。（共識(shí)7）   

除了嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)，ctDNA的檢測(cè)情況還與很多其他因素有關(guān)。例如患者的病情進(jìn)展情況，對(duì)于大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤，血漿中的ctDNA水平較低，突變等位基因分?jǐn)?shù)在晚期轉(zhuǎn)移性疾病中通常低于10%，在局部晚期非轉(zhuǎn)移性疾病中低于1%。ctDNA水平在癌癥早期和治療后更低，其突變等位基因頻率通常小于0.1%。而就同一個(gè)體而言，不同時(shí)段釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)里的ctDNA量也有差異，這些均有可能影響結(jié)果的檢出情況。所以，即使在液體活檢技術(shù)已有較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)展，就ctDNA的NGS檢測(cè)而言，依然有非常大的進(jìn)步改善空間。