揭示BTKi治療B細(xì)胞淋巴瘤的耐藥作用機(jī)制

該項(xiàng)研究揭示了BTKi治療B細(xì)胞淋巴瘤的耐藥機(jī)制。研究表明：臨床上發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致BTKi耐藥的BTK突變—C481F、C481Y、C481R和L528W，造成了BTK激酶活性的喪失，但并不影響BCR信號(hào)通路的功能發(fā)揮；在BTK激酶活性喪失的情況下，B細(xì)胞淋巴瘤的生長和存活更加依賴Toll樣受體TLR9。

研究背景

在B細(xì)胞發(fā)育過程中，抗原介導(dǎo)的BCR交聯(lián)誘導(dǎo)BTK活化，活化的BTK誘導(dǎo)PLCγ2活化，PLCγ2再通過水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，提升細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，進(jìn)而激活不同的轉(zhuǎn)錄程序，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，此過程即為BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

BTK是一種非受體酪氨酸激酶，臨床上已有針對(duì)該激酶的抑制劑用于B細(xì)胞淋巴瘤的治療，如ibrutinib、acalabrutinib和zanubrutinib等；其主要作用方式是通過結(jié)合到BTK的ATP結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)BTK的481位的半胱氨酸進(jìn)行共價(jià)修飾，進(jìn)而抑制BTK的激酶活性，抑制BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤的生長。在長期BTKi治療的過程中，患者會(huì)產(chǎn)生耐藥，臨床上已經(jīng)明確的耐藥機(jī)制是發(fā)生BTK突變。雖然前人已經(jīng)研究了B細(xì)胞淋巴瘤對(duì)BTKi的耐藥機(jī)制，但是導(dǎo)致耐藥的多種BTK突變體對(duì)BTK的生物化學(xué)活性或功能的影響并不清楚。

研究結(jié)果

在體外C481F/Y/R和L528W可損失BTK的激酶活性

為了探究BTK突變體對(duì)BTK激酶活性的影響，研究團(tuán)隊(duì)首先進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬：正常情況下，ATP的腺嘌呤環(huán)與BTK中T474側(cè)鏈和M477主鏈形成氫鍵；此外，ATP的磷酸基團(tuán)通過與K430側(cè)鏈形成兩個(gè)氫鍵而被鎖定在BTK的活性位點(diǎn)上；而C481和L528殘基位于BTK的ATP結(jié)合口袋下方，與ATP沒有直接相互作用。當(dāng)BTK C481發(fā)生突變，C481S不影響ATP的結(jié)合，但當(dāng)C481被苯丙氨酸（C481F）、酪氨酸（C481Y）或精氨酸（C481R）取代都會(huì)與ATP的糖環(huán)或磷酸基發(fā)生空間沖突。為了驗(yàn)證該模型的推測(cè)，采用熱位移實(shí)驗(yàn)（thermal shift assay），結(jié)果顯示ATP穩(wěn)定了BTK野生型（WT）、C481S和C481R的激酶結(jié)構(gòu)域，但沒有穩(wěn)定BTK C481F、C481Y和L528W的激酶結(jié)構(gòu)域。其次，進(jìn)行體外激酶活性分析，通過BTK激酶結(jié)構(gòu)域與PLCγ2多肽或者BTK的SH3結(jié)構(gòu)域蛋白共孵育，檢測(cè)ADP的產(chǎn)生，結(jié)果顯示：C481F、C481Y、C481R和L528W突變體與多肽或蛋白共孵育后，ADP的產(chǎn)生均降低，說明這些突變體均影響了BTK的激酶活性。

在DLBCL細(xì)胞中C481F/Y/R和L528W可損失BTK的激酶活性

體外驗(yàn)證顯示，BTK突變體影響BTK的激酶活性，那么在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中，是否具有相同的作用？對(duì)此研究團(tuán)隊(duì)通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式在TMD8 、OCI-LY10細(xì)胞系中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的BTK突變體（BTK WT, C481S/F/Y/R or L528W）或采用基因編輯技術(shù)構(gòu)建BTK L528W knock-in克隆，聯(lián)合深度pY的蛋白組學(xué)分析（采用DeepKinase專利的dSH2-superbinder pY富集技術(shù)）。研究結(jié)果顯示，在相對(duì)于親本細(xì)胞減少超過75%的pY肽中，有4個(gè)在C481F/Y/R中比較常見，如BTK pY223（自磷酸化位點(diǎn)），在C481F/Y/R和L528W中幾乎呈現(xiàn)缺失的狀態(tài)，說明在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中，C481F/Y/R和L528W突變體也同樣影響BTK的激酶活性。

在惡行B細(xì)胞中BTK激酶失活性突變?nèi)钥删S持致癌性BCR信號(hào)通路運(yùn)行

體內(nèi)、外研究均顯示，BTK突變體影響BTK的激酶活性，而BTK參與BCR信號(hào)通路，BTK激酶活性增加，誘導(dǎo)BCR通路下游分子的一系列活化或反應(yīng)，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的生長和分化，那么BTK突變后影響BTK的激酶活性，是否進(jìn)而可影響BCR信號(hào)通路？研究團(tuán)隊(duì)從PLCγ2的酪氨酸磷酸化和胞內(nèi)Ca2+流兩個(gè)方面（BCR通路下游的2個(gè)分子），來探究BTK突變對(duì)BCR信號(hào)通路的影響；主要通過采用WB、流式細(xì)胞術(shù)和基因敲除技術(shù)分別檢測(cè)PLCγ2的酪氨酸磷酸化水平和胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度；結(jié)果顯示：1. BTK突變后激酶活性損失，并不影響PLCγ2的酪氨酸磷酸化；2. BTK突變體中BTK激酶活性的損失，并不能有效影響胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度變化，通過基因敲除BTK后，胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度被有效降低，并在基因敲入對(duì)應(yīng)BTK突變體后，又表現(xiàn)出胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度的回升。綜上：BTK突變導(dǎo)致的BTK激酶活性的改變不能影響BCR信號(hào)通路，即BTK的激酶活性并不是BCR信號(hào)通路調(diào)節(jié)所必須的。

BTK激酶失活性突變避不開BCR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

BTK突變導(dǎo)致的BTK激酶活性損失，不能有效調(diào)節(jié)BCR信號(hào)通路，那么BTK突變體是否是避開了BCR通路，通過其它方式調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長或存活的？對(duì)此研究團(tuán)隊(duì)通過基因敲除BCR通路下游的一些關(guān)鍵基因，探究TMD8 親本細(xì)胞和TMD8 BTK L528W knock-in細(xì)胞的活性變化，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞活性變化趨勢(shì)完全一致，即隨著基因敲除時(shí)間的延長，細(xì)胞活性同等程度的降低。說明BTK突變細(xì)胞同BTK正常細(xì)胞一樣，均需要通過BCR通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖，但BTK突變體具體通過怎樣的方式參與調(diào)節(jié)BCR通路，目前還不清楚，需要做進(jìn)一步研究。

另外，研究團(tuán)隊(duì)通過PROTAC靶向蛋白降解技術(shù)，通過降解BTK突變體，進(jìn)一步降低細(xì)胞活性（TMD8和OCI-LY10 細(xì)胞），在一定程度上說明：靶向蛋白降解激酶失活的BTK突變體，可以克服BTKi長期治療帶來的耐藥作用。

BTK激酶失活的DLBCL 細(xì)胞的生長/存活是TLR9依賴性的

BTK激酶失活性突變體除了通過暫不清楚的方式參與調(diào)節(jié)BCR信號(hào)通路，是否在基因水平也起著相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，對(duì)此，研究團(tuán)隊(duì)通過全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)BTK激酶失活的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長或存活更依賴于TLR9信號(hào)。有研究表明，BCR也可以與TLR9和MYD88形成超級(jí)復(fù)合體，說明BTK具有介導(dǎo)BCR和TLR9之間的交聯(lián)對(duì)話作用，但具體作用機(jī)制也尚不清楚，需要進(jìn)行后續(xù)研究。

韓霆團(tuán)隊(duì)的此項(xiàng)研究工作，采用各種技術(shù)，包括體外的結(jié)構(gòu)模型分析、細(xì)胞的基因編輯技術(shù)、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建以及深度pY的蛋白組學(xué)分析等，進(jìn)行BTK激酶活性在B細(xì)胞淋巴瘤中作用的問題探究，為后續(xù)BTK在各種形式的B細(xì)胞惡性腫瘤中的非催化功能研究奠定了基礎(chǔ)。

此外，該論文在同行評(píng)議過程中也受到reviewers的高度評(píng)價(jià)，并入選JBC當(dāng)期“Editors'Picks”，凸顯其對(duì)BTKi耐藥性機(jī)制研究領(lǐng)域的重要意義。DeepKinase通過專利技術(shù)SH2-superbinder富集樣本中磷酸化的酪氨酸多肽，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，后續(xù)結(jié)合DoTK等技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸磷酸化多肽的深度組學(xué)分析。本研究中通過對(duì)酪氨酸磷酸化多肽的深度組學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平，探究BTK突變體和非突變體在磷酸化酪氨酸多肽水平的差異，并快速找出后續(xù)的分析靶點(diǎn)，相較于傳統(tǒng)的基于抗體的酪氨酸磷酸化多肽的檢測(cè)方案，省時(shí)、省力、省成本，且檢測(cè)范圍相對(duì)更廣。未來，DeepKinase將充分利用特有的專利技術(shù)，與更多單位開展長期而深入的合作。