一文讀懂冷凍電鏡（Cryo-EM）及其在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用

結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，對結(jié)構(gòu)進行解析有助于探究其作用機制。近年來，冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）在研究生物大分子結(jié)構(gòu)方面取得了突飛猛進的發(fā)展，在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視，逐漸成為一種被普遍接受的研究生物大分子的有效研究手段，成為連接生物大分子和細(xì)胞的紐帶和橋梁，為基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域帶來了新的突破。

冷凍電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)

冷凍電子顯微鏡的儀器結(jié)構(gòu)與透射電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)相似，只是在進樣之前搭載了液態(tài)乙烷罐與冷凍倉，保證在樣品快速冷凍后能夠即刻轉(zhuǎn)移至樣品倉內(nèi)。

冷凍電鏡發(fā)展過程

冷凍電子顯微鏡技術(shù)（cryo-electron microscopy）是在20世紀(jì)70年代提出的，早在20世紀(jì)70年代科學(xué)家們就利用冷凍電鏡研究病毒分子的結(jié)構(gòu)，提出了冷凍電鏡技術(shù)的原理、方法以及流程的概念。

到了20世紀(jì)90年代，隨著冷凍傳輸裝置、場發(fā)射電子槍以及CDD成像裝置的出現(xiàn)，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)出現(xiàn)。

21世紀(jì)初，冷凍電鏡技術(shù)進一步發(fā)展，利用三維重構(gòu)技術(shù)獲得了二十面體病毒的三維結(jié)構(gòu)，但此時冷凍電鏡的分辨率水平依然沒有得到突破，這限制了冷凍電鏡在生物大分子領(lǐng)域的應(yīng)用。

然而2013年12月5日，美國加州大學(xué)舊金山分校副教授程亦凡與同事David Julius兩個實驗室合作，采用單電子計數(shù)探測器，以近原子分辨率（3.4?），確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白TRPV1的結(jié)構(gòu)，這一振奮人心的成果讓研究人員們開始重新審視冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的所能發(fā)揮的作用。畢竟和X射線晶體學(xué)方法相比，它所需的樣品量很少，也無需生成晶體，這為一些難結(jié)晶的蛋白質(zhì)的研究帶來了新的希望。蛋白質(zhì)TRPV1結(jié)構(gòu)的確定標(biāo)志著冷凍電鏡正式跨入"原子分辨率"時代。

實驗流程

1. 蛋白樣本

包括蛋白的表達、純化過程。

2. 負(fù)染檢測及評估

一種簡單快速的評價樣本質(zhì)量的方法。將重金屬染色劑應(yīng)用于樣本，增強對比度，可以快速可視化地進行樣本質(zhì)量初步評估。這一步驟中主要評估樣 本的均勻性（蛋白/復(fù)合物狀態(tài)）、分散性、蛋白質(zhì)/復(fù)合物的大小和形狀、蛋白質(zhì)濃度（觀察顆粒分布情況）。

3.冷凍制樣及評估

在制備冷凍樣品之前應(yīng)確保樣品經(jīng)過完備的生化提純過程，以具備較低的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性；同時還要保證蛋白分子活性。冷凍制樣通常將微量樣本 （3-5μl）交由Vitrobot進行處理，制備出一層極薄的分子溶液層，并由液乙烷快速冷凍。冷凍后，樣品中的水分子不會形成結(jié)晶冰 ，而會形成無定 形（玻璃狀）冰層。此時樣本分子將較好地分布在冰層中。在開始采集數(shù)據(jù)前，仍需對冷凍樣品進行診斷評估，包括蛋白濃度、分布、穩(wěn)定性，冰層的質(zhì)量、厚度、均勻度和載網(wǎng)的均一性。

4. 數(shù)據(jù)采集、處理

高度穩(wěn)定的200kV及300kV冷凍電鏡提供高通量、自動化的數(shù)據(jù)收集。這一過程中透射電鏡將采集數(shù)萬張至數(shù)百萬張高分辨率單顆粒圖片，并由特定 的算法程序進行數(shù)據(jù)整理。

5. 三維重構(gòu)、模型建立

大分子的三維重構(gòu)依賴于對數(shù)以萬計的顆粒圖片進行平均，這個過程中數(shù)據(jù)需要經(jīng)過多步處理，需要調(diào)用適當(dāng)?shù)挠嬎阗Y源。在分析結(jié)構(gòu)前，需要進行 完好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)存儲架構(gòu)，用來支持可生成TB級數(shù)據(jù)的冷凍電鏡設(shè)施。三維重構(gòu)的核心是軟件算法，可用于測定及整合每一張照片的諸多參數(shù)如空間 取向，而后才能將二維的圖片整合重構(gòu)為三維的模型。

優(yōu)勢與不足

優(yōu)勢：

·             快速冷凍制樣處理，可使樣本保持近自然水合狀態(tài)

·             允許檢測同一靶蛋白的多種構(gòu)象

·             無需結(jié)晶，可解析業(yè)界難點膜蛋白

·             可解析大型蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

·             微克級樣品需求，對蛋白純度耐受性高

不足：

（1）樣品制備的困難。樣品制備的關(guān)鍵要求是顆粒朝向必須是隨機分布的，但樣品制備過程操作會對顆粒的隨機分布造成影響。

（2）要求樣品結(jié)構(gòu)均一性。多個顆粒的圖像數(shù)據(jù)必須進行合并和平均以形成3D重構(gòu)圖，若要實現(xiàn)高分辨率，就必須保持樣品結(jié)構(gòu)的均一。

（3）蛋白顆粒構(gòu)象多樣。理論上說，單顆粒冷凍電鏡的一大優(yōu)勢就在于能區(qū)別不同的功能構(gòu)象，但是有時候不同的構(gòu)象相似度太高，導(dǎo)致區(qū)別起來非常棘手。

（4）成像理論需要進一步研究。冷凍電鏡現(xiàn)有的成像理論是一種數(shù)學(xué)上的近似法。如果要進一步提高結(jié)構(gòu)解析的分辨率，就需要用到更為復(fù)雜的電鏡成像理論來提取圖像。近年來，在單顆粒分析中取得重大突破的是大似然估計理論，它在圖像匹配、2D和3D分類與模型優(yōu)化上均有應(yīng)用，是一個強有力的理論工具。但過多的計算資源消耗阻礙了這個方法在冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)中的廣泛應(yīng)用，如何在加快計算速度的同時，提高模型重構(gòu)的準(zhǔn)確性是大似然估計算法的一個重要問題。

Cryo-EM在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的應(yīng)用

案例1：2019-nCoV病毒

從歷史維度上看，冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的功勛建樹無需贅述。2020年新型冠狀（2019-nCoV）病毒疫情席卷全球，冷凍電鏡技術(shù)在解析病毒結(jié)構(gòu)、推測其侵染人體細(xì)胞的路徑等傳播原理發(fā)揮了重要作用。

病毒要進入人體細(xì)胞，就必須與人體細(xì)胞上相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合。新冠肺炎疫情暴發(fā)以來，新冠病毒表面與宿主細(xì)胞作用的關(guān)鍵刺突蛋白（S蛋白，Spike glycoprotein）備受各研究團隊的重視。得克薩斯大學(xué)的McLellan研究組采用冷凍電鏡技術(shù)，獲得純化S蛋白的3207張照片，結(jié)合已經(jīng)公開的新冠病毒序列，獲得了經(jīng)過3D重建的分辨率為3.5 ?的S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)。

發(fā)現(xiàn)2019-nCoV的S蛋白整體結(jié)構(gòu)與SARS病毒S蛋白的整體結(jié)構(gòu)相似，各個結(jié)構(gòu)之間具有高度同源性。它們之間大的差異是RBD在其各自的"向下"結(jié)構(gòu)中的位置差異。

結(jié)合冷凍電鏡獲取的病毒結(jié)構(gòu)與表面等離子共振技術(shù)（SPR）的分析結(jié)果，研究團隊表明，新冠病毒的S蛋白結(jié)合人體ACE2（宿主細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2）的親和力要遠(yuǎn)高于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）的S蛋白，這解釋了為什么新冠病毒傳染性要比SARS病毒強得多。

案例2：生命剪接體

Cryo-EM別適用于解析難以結(jié)晶的大分子復(fù)合物的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。通過在近生理狀態(tài)下觀察蛋白質(zhì)和其他生物大分子，Cryo-EM 揭示了它們的功能和動態(tài)變化。如圖2所示，中國科學(xué)院院士施一公教授團隊利用冷凍電鏡技術(shù)得到了關(guān)于近原子分辨率的生命剪接體三維結(jié)構(gòu)。

案例3：GCGR蛋白

2020年，在Science上發(fā)表了一篇G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）-GCGR蛋白的結(jié)構(gòu)信息，該蛋白的結(jié)構(gòu)解析工作由青云瑞晶的技術(shù)人員完成。

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）屬于膜蛋白，膜蛋白的膜內(nèi)區(qū)域具有廣泛的疏水表面，從膜上解離下來后在極性的水溶液中難以穩(wěn)定存在，往往無法使用常規(guī)的結(jié)晶方法獲得其結(jié)構(gòu)信息。該研究通過冷凍電鏡單顆粒法解析了GCGR與其同源配體胰高血糖素和異源三聚體Gs或Gi1蛋白的結(jié)構(gòu)，以研究GCGR與G蛋白相互作用的分子機制。