病毒樣顆粒疫苗：基因工程時代的另一個抗疫英雄

您是否曾想過有這樣一類疫苗，既能對抗各種致命病毒，又無需擔(dān)心可能帶來的副作用？答案就是--VLPs（Virus-Like Particles）病毒樣顆粒疫苗。

什么是VLPs？

VLPs是由病毒單一或多個結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白顆粒，大多數(shù)VLPs的空殼結(jié)構(gòu)為二十面體或螺旋形結(jié)構(gòu)，由幾種特異的結(jié)構(gòu)蛋白組成，它們有著和真正病毒十分相似的特征，易于被免疫系統(tǒng)識別，并以與真實構(gòu)象相似的途徑呈遞病毒抗原，從而誘導(dǎo)強烈的免疫反應(yīng)，但卻不含有病毒的遺傳物質(zhì)，因此無法復(fù)制或引發(fā)疾病[1]。簡單地說，VLPs疫苗提供了讓免疫系統(tǒng)"模擬演練"的機會，以便在遇到真正的病毒時能立即作出反應(yīng)進行反擊，并且VLPs疫苗自帶佐劑效應(yīng)，相當(dāng)于"打游戲自帶外掛"。您是否曾想過有這樣一類疫苗，既能對抗各種致命病毒，又無需擔(dān)心可能帶來的副作用？答案就是--VLPs（Virus-Like Particles）病毒樣顆粒疫苗。

VLPs作為亞單位疫苗的一種，因具有安全、高效、可實現(xiàn)鑒別診斷的突出優(yōu)勢，近年來也被認為是有可能替代傳統(tǒng)滅活疫苗的佳候選疫苗形式。VLPs疫苗的制備過程一般包括以下步驟:病毒結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建與克隆、宿主表達系統(tǒng)選擇、分離純化、分析鑒定等[2]。

VLPs疫苗的分類

根據(jù)原始病毒的結(jié)構(gòu)，VLPs疫苗可分為有包膜和無包膜兩類。無包膜的VLPs疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒，如諾瓦克病毒和戊型肝炎病毒，一般由原核表達系統(tǒng)和低級真核表達系統(tǒng)實現(xiàn)。有包膜的病毒除了病毒本身的蛋白外，還包含宿主的細胞膜，比如A型流感病毒和乙型肝炎病毒，一般由真核表達系統(tǒng)實現(xiàn)。

VLPs疫苗優(yōu)勢在哪？

1）、安全性：VLPs不含復(fù)制酶和編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，缺乏復(fù)制能力；

2）、高效的免疫保護力：VLPs自組裝疫苗能夠激活機體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的抗體和細胞免疫應(yīng)答，提供長期、持久的免疫保護;

3）、廣泛適應(yīng)性：VLPs自組裝疫苗可針對不同病原體進行設(shè)計，包括病毒、細菌等，為多種傳染病的預(yù)防和治療提供了新的選擇；

4）、表達系統(tǒng)多樣性：大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物等多種表達體系均可用于表達VLPs；

5）、穩(wěn)定性和易制備性：VLPs疫苗具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠在極端條件下保存，容易通過工程方法大規(guī)模制備，可實現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)。

這么優(yōu)的疫苗，以前怎么沒聽說過？

其實不然，20世紀(jì)80年代以來，VLPs逐漸替代傳統(tǒng)疫苗成為疫苗制備的首[3]，并且作為炎癥、疼痛、過敏、腫瘤等治療性疫苗，早已滲透在我們的生活當(dāng)中。例如乙肝疫苗、戊肝疫苗、宮頸癌疫苗和流感疫苗等都是"現(xiàn)役"經(jīng)典的VLPs疫苗，并且由默沙東開發(fā)的乙型肝炎病毒（HBV，簡稱乙肝）疫苗作為全球首VLPs疫苗早在1986年就已獲批上市，隨后以預(yù)防人乳頭瘤病毒、戊型肝炎病毒等為適應(yīng)癥的預(yù)防疫苗相繼上市。

VLPs疫苗的表達系統(tǒng)

VLPs常用表達系統(tǒng)包括大腸桿菌、桿狀病毒/昆蟲細胞、酵母及哺乳動物細胞、無細胞表達系統(tǒng)等，約有170種不同的宿主表達系統(tǒng)可用，目前已報導(dǎo)的VLPs疫苗約70％基于真核表達系統(tǒng)，30％基于原核表達系統(tǒng)，并且已有100余種VLPs被制備及鑒定。

VLPs疫苗的純化與組裝

病毒樣顆粒的純化主要包括4個步驟，分別是裂解、粗提、濃縮和精制[4]。

1、裂解：當(dāng)宿主表達的組裝VLPs無法分泌至胞外時，純化時需要先對細胞進行裂解[5]，哺乳動物和昆蟲細胞一般采用去污劑處理，而高壓、超聲、研磨以及凍融等方法[6-7]則多用于細菌、酵母和植物細胞。裂解過程中重要的是防止蛋白降解，因此需要根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)選擇合適的緩沖體系，并添加蛋白酶抑制劑和蛋白穩(wěn)定劑［8］。

2、粗提：這一步是將細胞碎片和大聚合物去掉[9]。離心是蛋白粗提過程中常用的方法，一般使用低速離心機或者連續(xù)流離心機[5]。

3、濃縮：這一步主要的目的是去除雜蛋白和提高目的蛋白濃度。濃縮的方法有很多，包括硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀、蔗糖氯化銫梯度超速離心、離子交換層析、疏水層析及親和層析等[10]。

4、精純：精制的主要目的是去除宿主自身表達的蛋白質(zhì)和DNA，同時去除工藝過程引入的雜質(zhì)。精純主要采取離子交換層析、膜裝置和分子排阻等方法。

5、組裝：由于不完全或者不規(guī)則的組裝會導(dǎo)致VLPs疫苗效果的下降，因此，有時需要對VLPs進行去組裝和重組裝處理，以提高VLPs的穩(wěn)定性、均一性和免疫原性[11]。而且需要根據(jù)VLPs自身性質(zhì)選擇合適緩沖體系，例如HPV16L1 VLPs的去組裝需要在高pH、低鹽和還原劑的溶液下進行，重組裝則需要在低pH、高鹽和去還原劑的條件下進行[9]。

病毒樣顆粒的鑒定

在制備VLPs的過程中，要對VLPs的制備情況進行檢測，主要通過以下4個方面：性質(zhì)、含量、效果和純度。

1、性質(zhì)：VLPs性質(zhì)的檢測主要包括VLPs的形態(tài)、大小、氨基酸序列、相對分子質(zhì)量、降解修飾情況、中和表位、抗原特異性等方面[12]。方法包括SDS/PAGE法、Western Blot法、ELISA法、表面等離子體共振技術(shù)、投射電子顯微鏡法、免疫電鏡法、蛋白質(zhì)測序法、質(zhì)譜法等。

2、含量：主要的方法有ELISA法、BCA法、Bradford法、紫外分光光度法等。

3、效力：證明VLPs疫苗效果的關(guān)鍵，主要包括體外試驗，如血凝抑制試驗；體內(nèi)試驗，如免疫試驗、攻毒試驗等。

4、純度：檢測純化和精制效果的關(guān)鍵，同時也與能否用于臨床試驗相關(guān)。純度檢測主要檢測VLPs結(jié)構(gòu)蛋白的純度、VLPs的組裝率、宿主DNA和蛋白的殘余、蛋白核酸復(fù)合物的多少等。主要的方法有ELISA法、SDS/PAGE法、DNA染色方法、瓊脂糖凝膠電泳遲滯試驗、透射電鏡檢測法等[8]。

VLPs疫苗的未來

VLPs疫苗，作為一種無活性、高效率的疫苗制備方式，正在改變我們對未來免疫防御的認知。同時由于其對目標(biāo)宿主細胞的天然親和力特性已被用于如基因治療、靶向給藥等細胞靶向應(yīng)用，也可與探針結(jié)合應(yīng)用于生物成像或揭示病毒感染機制等基礎(chǔ)研究當(dāng)中，VLPs代表著免疫科學(xué)的前端進展，提供了一種強大且安全的工具為人類健康做貢獻。