乙型肝炎病毒X基因?qū)Ω伟┘毎鸅el7404細胞周期的影響

　　作者：林松挺1,陳正義1,陳瑩暉2,程斌　　作者單位：海南醫(yī)學(xué)院科研基金資助學(xué)報項目(0020100315)(1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院消化內(nèi)科，海南 海口 570208;2 海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)學(xué)中心ICU，海南 ?？?570102;3 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，

　　【摘要】目的：構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細胞株Bel7404/HBx,研究HBx對肝癌細胞周期及凋亡的影響，為探索HBx與原發(fā)性肝細胞癌(HCC)之間的關(guān)系提供更為完善的理論依據(jù)。方法：運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及G418篩選獲取Bel7404/HBx陽性克隆，并分別用聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)和Westernblot鑒定HBx mRNA與蛋白的表達，進一步用四唑蘭比色實驗(MTT)檢測Bel7404/HBx的增殖，流式細胞儀(FCM)檢測Bel7404/HBx的細胞周期及凋亡。結(jié)果：成功構(gòu)建Bel7404/HBx，MTT檢測結(jié)果表明Bel7404 /HBx生長速度加快，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,與對照組細胞相比, Bel7404 /HBx凋亡率明顯降低(P<0.05)，G1期細胞比例降低(P<0.05), S期及G2期細胞所占比例增高(P<0.05)。結(jié)論:HBx能加速細胞周期進程，從而促進肝癌細胞的生長并抑制細胞凋亡，可能對肝癌細胞惡性程度具有重要的影響。

　　【關(guān)鍵詞】 HBx,原發(fā)性肝細胞癌,聚合酶鏈反應(yīng);免疫印跡;四唑蘭比色實驗;流式細胞術(shù)

　　ABSTRACT] ob[x]jective: To establish transgenic cell lines Bel7404/HBx, study the influence of HBx on cell cycles and apoptosis, and provide more extensive theories for exploring the relationship between HBx and hepatocellular carcinoma (HCC). Methods: The Bel7404/HBx positive clones were obtained by Lipofectamine tranfection and G418 selection, then HBx mRNA and protein were detected by reverse transc[x]ription polymerase chain reaction(RTPCR) and Western blot, respectively. The tetrazolium blue colorimetric test (MTT) and flow cytometer ( FCM) were used to measure proliferation, cell cycles and apoptosis of Bel 7404/HBx. Results: Bel7404/HBx was successfully established. MTT showed that the Bel7404 / HBx grew faster than the control group (P<0.05), and FCM showed that compared with cells in control group, the apotosis rates of Bel7404/HBx were at a low level, cells in G1 phase decreased but increased in S and G2 phase in proportion(P<0.05). Conclusions: HBx can accelerate cell cycle progression to promote the growth of hepatoma cells but inhibit apoptosis, which indicates that it may have great influence on the malignant degree of hepatocellular carcinoma.

　　KEY WORDS] HBx; Hepatocellular carcinoma; RTPCR; Western blot; MTT; FCM

　　原發(fā)性肝細胞癌(HCC)一直以來是危害人民身心健康的一大疾病，其發(fā)病機理多種多樣，其中HBV在其發(fā)病中一直占據(jù)重要的地位。目前研究證實，HBV中小的閱讀框X基因在HCC發(fā)生中所起的作用至關(guān)重要，但各家研究結(jié)論不太一致，有的結(jié)論甚至互為矛盾，這也使得HBx致癌機理尚未研究清楚。因而，HBx致HCC機理仍然是目前研究的熱點，為此，我們以重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) /v5hisBHBx作為載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將X基因?qū)敫伟┘毎鸅el7404細胞系中，用G418篩選獲取穩(wěn)定表達HBx蛋白的陽性克隆，并觀察HBx對肝癌細胞Bel7404增殖、凋亡及細胞周期的影響，為進一步探索HBx與HCC之間的關(guān)系提供更為完善的理論依據(jù)，希望能為肝細胞癌的預(yù)防、診斷及治療提供新的策略。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　Effectene Transfection Reagent(Qiagen);G418(Promega);各種限制性核酸內(nèi)切酶、聚合酶等(Takara);鼠單克隆抗體(ABCam);羊抗鼠IgG(晶美);DMEM 、MTT及PI(sigma)。重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)/v5hisBHBx由上海第二軍醫(yī)大學(xué)遺傳研究所何曉文教授惠贈;DH5α由西班牙Navarra大學(xué)癌癥基因研究所錢程教授提供;Bel7404細胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所劉新垣院士惠贈。擴增HBx基因片段上游引物為：5′ CGGAATTCCGATGGCTGCTAGGCTGTG3′,命名為P1,下游引物為：5′CCCTCGAGGGTGCATGGTGCTGGTGA3′,命名為P2，擴增目的片段為445bp,PCR引物合成及測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Bel7404細胞的轉(zhuǎn)染與篩選 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)/v5hisBHBx經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后按Effectene Transfection Reagent說明書進行轉(zhuǎn)染操作，48h后用含500mg/L G418的選擇培養(yǎng)基篩選陽性克隆。篩選至對照組細胞全部死亡后實驗組存活的細胞即為陽性克隆，挑取克隆擴大培養(yǎng)并將G418濃度減至250mg/L維持篩選，以獲得穩(wěn)定表達HBx的轉(zhuǎn)基因細胞株(Bel7404/HBx)。實驗設(shè)空白對照組(Bel7404細胞)與空載體對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的Bel7404細胞，Bel7404/ pcDNA3.1)。以下所設(shè)對照組與此相同。

　　1.2.2 轉(zhuǎn)基因細胞株Bel7404/HBx的鑒定 采用聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測HBx mRNA的表達: TRIzol一步法提取各組細胞總RNA(按試劑盒說明書操作)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，取2μL cDNA作模板，以上述引物擴增HBx基因片段，條件如下：94℃預(yù)變性10min，94℃變性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，擴增30個循環(huán)，2%瓊脂糖凝膠電泳后成像觀察。Western blot檢測HBx 蛋白的表達:各組細胞培養(yǎng)48h后置冰上PBS洗滌2次，加入冰預(yù)冷的細胞裂解液100μL(按1∶100加入PMSF)充分裂解細胞，4℃ 13000g離心2min,上清即總蛋白，轉(zhuǎn)上清至另一EP管中,加入適量2×SDS凝膠加樣緩沖液(65mmol/L TrisHCl,pH：6.8;100mmol/L DTT;2%SDS;0.1%溴酚藍;10%甘油),100℃加熱5min使蛋白變性,4℃ 3600g離心2min,采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度(按說明書操作),取適量蛋白樣品行SDSPAGE電泳，然后半干轉(zhuǎn)印于NC膜上，封閉液室溫封閉1h，加入鼠單克隆HBx抗體(一抗)，4℃孵育過夜，以TBST振搖洗滌3次，每次5min，加入羊抗鼠IgG(二抗)，室溫孵育1h，接著以TBST振搖洗滌4次，每次5min，直接用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測結(jié)果。

　　1.2.3 四唑蘭比色實驗(MTT)檢測細胞的增殖及凋亡 各組細胞消化后配成單細胞懸液，以1×104細胞/孔接種于96孔板，共4板，各設(shè)4復(fù)孔,另設(shè)一PBS對照孔。培養(yǎng)24h后，取出1板每孔加MTT溶液(0.5g/L)100μL，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150μL的DMSO，振搖15min溶解結(jié)晶，酶聯(lián)免疫檢測儀于595nm波長處分別測定各孔光吸收值(A值)，取其均數(shù)作為本次A值計數(shù)值。培養(yǎng)48、72、96h后再重復(fù)上述步驟檢測，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制各組細胞生長曲線圖。

　　1.2.4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期及凋亡情況 將各組細胞收獲后，用PBS洗滌1次，-20℃ 75%乙醇固定過夜，取出離心收集細胞，PBS洗滌2次，加入10g/L Rnase37℃孵育15min,再加入碘化丙錠(PI)染色30min，300目尼龍網(wǎng)過濾，采用FAC SAricaTM流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡狀況。各組細胞再加入誘導(dǎo)凋亡佳濃度的ADM培養(yǎng)48h后用上述相同方法處理，上機檢測細胞凋亡及細胞周期的變化。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

　　采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，流式細胞儀檢測的凋亡率及細胞周期的比較采用χ2檢驗。MTT檢測細胞增殖的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 Bel7404/HBx的篩選

　　采用G418濃度為500mg/L的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)14d后,對照組細胞全部被殺死, 轉(zhuǎn)染HBx基因的Bel7404細胞可見有陽性克隆的形成。

　　2.2 HBx基因表達檢測結(jié)果

　　林松挺等.乙型肝炎病毒X基因?qū)Ω伟┘毎鸅el7404細胞周期的影響

　　RTPCR顯示，實驗組Bel7404/HBx及重組質(zhì)粒pcDNA3.1/HBx可見HBx條帶，而空白對照組Bel7404細胞與空載體對照組Bel7404/pcDNA3.1均未見HBx條帶(圖1)，表明Bel7404/HBx在轉(zhuǎn)錄水平上有HBx mRNA的表達;Western blot顯示實驗組可見HBx蛋白表達條帶，而空白對照組與空載體對照組則未見HBx蛋白表達條帶(圖2)。表明穩(wěn)定表達HBx的轉(zhuǎn)基因細胞株Bel7404/HBx構(gòu)建成功。

　　圖1 RTPCR鑒定陽性克隆中HBx mRNA的表達

　　圖2 Western blot鑒定陽性克隆中HBx蛋白的表達

　　2.3 細胞增殖情況

　　MTT法檢測各組細胞A值發(fā)現(xiàn)，Bel7404與Bel7404/pcDNA3.1細胞生長速度基本一致(P>0.05)， 而Bel7404/HBx細胞在48、72、96h各時間點的A值均明顯高于對照組Bel7404細胞和Bel7404/pcDNA3.1(P<0.05), 表明Bel7404/HBx細胞生長速度明顯加快(圖3)，顯示HBx對Bel7404細胞具有促增殖作用。

　　圖3 Bel7404 /HBx、Bel7404/pcDNA3.1和Bel7404細胞生長曲線

　　2.4 流式細胞儀檢測凋亡及細胞周期

　　各組細胞培養(yǎng)48h經(jīng)PI單染后用FACSAricaTM flow cytometer檢測，重復(fù)實驗3次，每次每組檢測5×104個細胞，結(jié)果顯示，與對照組相比，Bel7404/HBx凋亡率降低(P<0.05)，G1期細胞比例減少(P<0.05)，S期與G2期細胞比例相應(yīng)增加(P<0.05),見表1。

　　表1 3組細胞的凋亡率及各細胞周期所占比例的比較 %(±s)

　　組別凋亡率

　　細胞周期

　　G1SG2

　　空白對照組(Bel7404)12.64±0.0262.38±0.0336.03±0.011.36±0.02

　　空載體對照組(Bel7404/pcDNA3.1)9.58±0.0163.46±0.0136.01±0.000.53±0.00

　　實驗組(Bel7404/HBx)2.97±0.01*52.64±0.01* 41.08±0.01* 5.51±0.00*

　　注：與對照組相比，*P<0.05。

　　3 討論

　　HCC是世界范圍內(nèi)惡性程度高的腫瘤之一，每年有超過50萬人死亡，我國為肝癌高發(fā)區(qū)，病死率在各種腫瘤中占前列，占癌癥死亡率第2位。雖然目前肝癌的研究已有長足的進步，但其預(yù)后仍然很差，因此，肝細胞癌是嚴(yán)重危害人民身心健康的惡性腫瘤之一，故深入研究HCC的分子機制對肝癌提供新的防治策略具有十分重要的意義。研究證實，HBV基因組共有4個開放閱讀框：prec/c、p、pres/s與X基因[1，2]，其中X基因是小的一個開放閱讀框，編碼基因區(qū)位于 1374～1838核苷酸之間，編碼產(chǎn)物為HBx蛋白,具有強大的生物學(xué)功能，包括反式激活病毒基因組和宿主細胞基因的轉(zhuǎn)錄、增強轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合特性、抑制P53蛋白活性、抑制細胞DNA的修復(fù)、參與細胞信號傳導(dǎo)途徑和細胞凋亡的調(diào)控等[3]，這些功能可能與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生具有密切的關(guān)系[4-7]。研究證實，HBx在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化及癌變[8，9]，這些為HBx引發(fā)原發(fā)性肝細胞癌提供了依據(jù)。但也有研究表明，單純的HBx基因表達并不足于引起肝細胞癌，可能是細胞惡性轉(zhuǎn)變的一個促進因素,也就是增加機體對致癌物質(zhì)誘導(dǎo)肝癌的易感性[4，8]。由此可見，HBx致癌機制復(fù)雜，且目前的研究尚不能確定HBx在HCC中的確切作用[4，8]，許多研究結(jié)果仍存在很大爭議，有的結(jié)果甚至相互矛盾，故HBx致癌機理一直是近年研究的熱點。

　　到目前為止，為了研究 HBx的功能以及HBx致HCC的機理，已建立了多種 HBV X基因表達體系，但因受實驗條件、細胞類型、培養(yǎng)環(huán)境以及HBV感染的階段等因素的影響而導(dǎo)致HBx表達的差異，進而影響實驗的結(jié)果，這也可能是目前研究結(jié)果存在爭議的原因之一。因此，在一種細胞模型或動物模型實驗研究中得出的結(jié)果并不一定能反映在人體的實際情況，必須用多種模型去驗證及研究，為全方位、多方面揭示HBx致HCC機理提供更多的理論依據(jù)，盡可能發(fā)現(xiàn)先前互為矛盾的真諦所在，并采取有針對性的研究措施，為以后研究HCC的致病機理取得更進一步的突破。為此，本實驗通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將HBx基因?qū)隑el7404細胞中，通過G418篩選獲取陽性克隆，并進行RTPCR和Western blot檢測HBx mRNA和HBx蛋白的表達情況，實驗結(jié)果表明在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均有HBx的表達，表明穩(wěn)定表達HBx的轉(zhuǎn)基因細胞模型Bel7404/HBx構(gòu)建成功。在此基礎(chǔ)上用MTT檢測了Bel7404/HBx 、 Bel7404/pcDNA3.1和 Bel7404細胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bel7404/HBx的生長速度遠遠高于其它兩組細胞，這些說明HBx具有促進細胞增殖的作用。進一步通過流式細胞儀分別檢測Bel7404/HBx 、 Bel7404/pcDNA3.1和 Bel7404細胞周期特點和凋亡情況，結(jié)果顯示，Bel7404/HBx細胞凋亡率較低，只有(2.97±0.01)%，而其它兩組對照組細胞Bel7404/pcDNA3.1和Bel7404的凋亡率較高，分別達到(9.58±0.01)%和(12.64±0.02)%，具有顯著性差異(P<0.05)，細胞周期中Bel7404/HBx在G1期比例下降，S期與G2期所占的比例增高，這說明HBx可能有加速細胞周期，促進細胞生長，抑制細胞凋亡的作用。由此可以推斷,HBx可促進細胞DNA的復(fù)制,加速細胞周期的進程,與大多文獻報道相一致[9-12],所有這些表明, HBx對Bel7404肝癌細胞影響極大,可能對肝細胞癌惡性程度、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生重要的影響,這對進一步研究HBx致HCC的確切機制,探索HCC新的防治策略具有十分重要的啟示。