結直腸癌腫瘤干細胞研究進展

         結直腸癌是嚴重危害人類健康而又常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和死亡率成明顯上升趨勢。腫瘤組織中少數(shù)具有自我更新能力的細胞能夠增殖分化成新的腫瘤細胞，被稱為腫瘤干細胞(cancerstemcells,CSC)，是腫瘤形成、耐藥、復發(fā)和轉移的罪魁禍首，結直腸癌干細胞的研究對結直腸癌的診斷、預防及治療具有重要意義。

         一、腫瘤干細胞
         根據(jù)2006年美國癌癥協(xié)會的定義，腫瘤干細胞指腫瘤內(nèi)具有自我更新能力和形成異質(zhì)性腫瘤的細胞亞群。該細胞只占腫瘤細胞的一小部分，卻是腫瘤耐藥、復發(fā)和轉移的根源。1994年，Lapidot等對急性粒系白血病細胞的研究證實CSC的存在:占白血病細胞總數(shù)0.01%}1.00%的CD34'CD38一腫瘤細胞移植人SLID裸鼠后能誘導形成白血病，而CD34'CD38+和CD34一細胞亞群則不具備該能力。2003年，腫瘤干細胞在實體腫瘤中得到證實，Al-Hajj等[3從乳腺癌組織中分離出CD44'/CD24-/low細胞亞群，并發(fā)現(xiàn)該亞群具有腫瘤形成能力。隨后腫瘤干細胞先后在肺癌川、卵巢癌’

         一、肝癌[6、胰腺癌川、膠質(zhì)瘤[8」和結直腸癌叫腫瘤中得到證實。

         二、腫瘤干細胞與結直腸癌的發(fā)生
         1.腸道干細胞:腸勃膜表面由單層柱狀上皮細胞組成，這些上皮細胞向固有層內(nèi)陷而形成隱窩。Potten等認為，腸茹膜隱窩基底部是腸道干細胞的細胞庫，腸干細胞位于隱窩的基底部，每個隱窩有2-6個腸干細胞，周圍的“小生境”(niche)對腸干細胞的增殖和分化起重要作用，腸干細胞向隱窩上部分化遷移，于腸腔表面分化為成熟腸上皮細胞，取代老化脫落的上皮細胞。正常情況下，新形成分化細胞的數(shù)量與老化細胞死亡脫落的數(shù)量呈平衡狀態(tài)。

         2.結直腸癌腫瘤干細胞的起源:關于結直腸癌腫瘤干細胞的起源，目前有兩種學說，種學說認為，腫瘤干細胞來源于正常腸道干細胞的突變〔tz};第二種學說認為，由腸道分化成熟的細胞轉化而來。不過，腫瘤干細胞起源于成體干細胞的突變得到了更多的證據(jù)支持。成體干細胞比分化成熟的細胞具有更長的生存周期，更易積累足夠的突變從而轉化為惡性的腫瘤干細胞。Sell認為，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由于正常干細胞分化受阻，而不是成熟細胞的去分化。研究發(fā)現(xiàn)，結直腸癌的很多基因的突變與腸干細胞相關。Fearon等〔to」發(fā)現(xiàn)，APC基因的突變是結直腸癌發(fā)生的早期事件，同時可引發(fā)隱窩基底干細胞的擴增。結直腸腫瘤干細胞與腸道干細胞具有許多相似之處，如無限增殖自我更新能力和共同的Wnt,Notch及Hedgehog信號調(diào)節(jié)通路以及端粒酶的高活性和向特定組織分化等.
         三、結直腸癌腫瘤干細胞的標志物
         使用流式細胞技術根據(jù)特異性的標志物分離得到CSC，是腫瘤干細胞研究的前提和基礎。不過，目前除了血液腫瘤外，在其余實體腫瘤包括結直腸癌干細胞并未找到特異性的標志物，根據(jù)常用的CD133,CD44等標志物只能起到“富集”干細胞的作用，分選得到的細胞群體中有相當一部分細胞并不具備成瘤能力。 
        

         1.CD133";CD133作為結直腸癌干細胞標志物早由0'Brien等[9)和Ricci-Vitiani等[15」報道。此后，CD133成為使用為廣泛的腫瘤干細胞標志物。0'Brien等[9J從人結直腸癌手術切除標本中分離到1.7%-22.4%的CD133十腫瘤細胞，將CD133十細胞接種于NOD/SCID鼠腎被囊，發(fā)現(xiàn)能夠重建結直腸腫瘤，而CD133一細胞不具備該能力。Ricci-Vitiani等研究發(fā)現(xiàn)，CD133+細胞占腫瘤組織的2.5%左右，不同濃度CD133十細胞皮下接種NOD/SLID裸鼠可成瘤，病理類型與原代腫瘤一致;同時，腫瘤組織中分化出CD133一細胞;CD133十細胞連續(xù)傳代后腫瘤生長加快，且CD133+細胞數(shù)量保持一定比例;而接種105的CD133一細胞不能成瘤在CD133被廣泛用作腫瘤標志物的同時，有人提出了質(zhì)疑。Shmelkov等廠}e7建立了在CD133基因的啟動區(qū)域轉入報告基因lacZ的遺傳小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，CD133廣泛表達于成年小鼠結腸上皮細胞;用CD133抗體免疫組化檢測正常人體結腸上皮，顯示CD133蛋白表達于絕大多數(shù)分化成熟的腸上皮細胞;同時發(fā)現(xiàn)，從結腸癌肝轉移組織中分離得到的CD133一細胞具有比CD133+細胞更強的成瘤能力.EpCAM/CD44/CD166;Dalerb。等[n從6例結腸癌組織中分離得到EpCAMhigh/CD44·和EpCAMIow/CD44一細胞，注射于NOD/SLID裸鼠，發(fā)現(xiàn)200一500個EpCAMhigh/CD44‘細胞可成瘤，而10'個EpC.AMlow/CD44一細胞不能成瘤。他們應用系統(tǒng)評價的方法發(fā)現(xiàn)，EpCANIhigh/CD44'群體基本包含在CD133+細胞群體之內(nèi)，也許使用EpCAM/CD44比單獨使用CD133能更進一步富集腫瘤干細胞。此外，他們提出CD166可作為一種聯(lián)合的標志物富集腫瘤干細胞。 
         3.CD133/CD44;Haraguchi等提出，CD133聯(lián)合CD44能更好地富集腫瘤干細胞，他們將結直腸癌分選為3個亞群:CD133*/CD44',CD133'/CD44一和CD133-CD44-，皮下注射于NOD/SLID裸鼠，發(fā)現(xiàn)只有CD133`/CD44十具備成瘤能力。Chen等「I9」發(fā)現(xiàn)，103的CD133'/CD44‘細胞能使NOD/SLID裸鼠致瘤，而10，非CD133"/CD44+細胞無法成瘤。體內(nèi)外實驗證實，CD133}/CD44+細胞具有更強的轉移能力，并高表達上皮間質(zhì)轉化標志物，可能是腫瘤細胞發(fā)生遠處轉移的特定細胞亞群。 
         4醛脫氫酶1(aldehydedehydrogenase1，ALDH1):ALDH1被證實能維持干細胞的存活，近來被認為是一個有前景的CSC標志。Huang等}w;對7例結直腸癌的研究顯示，ALDH1'EpCAM十細胞范圍在(3.5士1.0)%,500個ALDH1EpCAM+細胞皮下注射于NOD/SLID裸鼠能形成腫瘤，而105的ALDH1-EpCAM十細胞不能形成腫瘤。該研究提示，ALDH1是結腸CSC的一個標志，結合CD133可以增加CSC的富集。 四、腫瘤干細胞的信號轉導通路調(diào)控腸道干細胞和腫瘤干細胞有著相似的信號通路調(diào)控機制，由于腸道干細胞通路調(diào)控紊亂導致惡性轉變，成為腫瘤干細胞的重要發(fā)生機制。腫瘤干細胞信號通路的研究不僅有助于腫瘤發(fā)生機制的闡明，對于通路關鍵靶點的干預亦能夠成為消滅腫瘤干細胞的有效策略。 1.Wnt通路:結直腸癌組織檢測通常發(fā)現(xiàn)Wnt通路的異常激活，APC基因的失活突變往往是腫瘤形成的起始事件’氣同時研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路同樣是維持干細胞干性的關鍵通路0。Kanwar等發(fā)現(xiàn)，Wnt通路在結直腸癌十細胞中被異常活化，利用RNA干擾技術阻斷一catenin，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞成球能力減弱，CD44*細胞數(shù)量減少，表明Wnt通路在結直腸癌腫瘤干細胞的維持中起重要作用2.Notch通路:Notch通路同樣是維持干細胞的一條重要通路。Fre等m一激活腸道上皮細胞的Notch通路，結果發(fā)現(xiàn)了腸道分化上皮細胞的減少和干性細胞的增多。Sikandar等za}利用成球培養(yǎng)法富集腫瘤干細胞，發(fā)現(xiàn)Notch通路活化比普通腫瘤細胞高出10--30倍，利用RNA干擾技術，發(fā)現(xiàn)Notch通路可以通過P27和}TOH1抑制腫瘤干細胞的凋亡，并抑制分化基因}ICC2從而維持其干性3.Hedgehog通路:多項研究證實，Hedgehog信號通路在多發(fā)骨髓瘤、乳腺癌和惡性膠質(zhì)瘤的干細胞中高表達，并在腫瘤干細胞自我更新中起重要作用〔zs-zpLiu等f}7激活乳腺癌干細胞的Hedgehog通路可以刺激腫瘤細胞成球培養(yǎng)，提高腫瘤干細胞的數(shù)量，這一過程可以被SMOH的抑制劑環(huán)巴明(cyclopamine)阻斷，證明Hedgehog通路通過Bmi-1參與乳腺癌干細胞的自我更新和維持。Varnat等aft敲除Hedgehog信號可導致結直腸癌干細胞數(shù)量明顯減少體外干細胞培養(yǎng)條件下幾乎不能形成球樣細胞。相反，激活Hedgehog信號則使直腸癌干細胞數(shù)量明顯增加。

         五、研究意義和治療策略
         在傳統(tǒng)的治療方式下，腫瘤干細胞具有更強的生存優(yōu)勢，化療和放療無法完全殺滅腫瘤干細胞，成為腫瘤復發(fā)和轉移的根源。在傳統(tǒng)治療方式的同時，如果能聯(lián)合使用有效殺滅腫瘤干細胞的治療策略，可終達到真正治愈腫瘤的目的。針對腫瘤干細胞生物學特性，研究者們開展了一系列治療設想和嘗試。

         1.以細胞表面標志物為靶點:腫瘤干細胞表面的特異性標志物可以成為殺滅細胞的有效靶點。急性髓性白血病以不成熟髓細胞在骨髓里聚集及骨髓造血抑制為特征，骨髓髓樣干細胞分化成熟障礙，停止在早期髓性分化階段。而腫瘤干細胞標志物CD44在促進髓性分化中起重要作用「z9-3o}。因此，可以利用CD44激活性抗體促進髓樣干細胞分化。Charrad等[[3l〕在體外實驗中利用CD44抗體有效逆轉髓樣干細胞分化阻滯.并促進腫瘤干細胞的凋亡。Jin等將白血病干細胞移植進小鼠體內(nèi)，并注射CD44激活性抗體H90，發(fā)現(xiàn)能有效抑制I,SCs的遷移和增生。提示，CD44可能成為殺滅腫瘤干細胞的有效靶點。不過，由于該標志物缺乏特異性，在殺滅腫瘤十細胞的同時如何避免影響正常組織細胞，是人們需要關注的重要問題。

         2.阻斷腫瘤干細胞的維持通路:腫瘤于細胞通路的研究不僅有助于腫瘤發(fā)生機制的闡明，對通路關鍵分子的干預也是腫瘤干細胞靶向治療的重要策略。Lin等s;發(fā)現(xiàn)，STAT3通路在腸癌細胞系的ALDH'/CD133十細胞過度活化，維持腫瘤于細胞的自我更新和十性，給予STAT3抑制劑FLLL32,能有效減少細胞系中ALDH'/CD133一細胞數(shù)量以及細胞成球能力。Kanwar等翌發(fā)現(xiàn)，通路在結直腸癌干細胞中活化，siRNA干擾一catenin的表達則導致腫瘤干細胞數(shù)量的減少。Sikandar等，利用Notch通路關鍵分子yJecretase的抑制劑D_4PT處理結直腸癌干細胞，發(fā)現(xiàn)Notch通路被抑制的同時，腫瘤于細胞數(shù)量下降了50%，在體外3D培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)干細胞分化為上皮和杯狀細胞說明腫瘤干細胞異?；罨耐芬种苿┛梢宰鳛橐环N殺滅腫瘤十細胞的有效策略。

         3.增強腫瘤干細胞的化療敏感性:化療對于增殖活躍的腫瘤細胞有較好的殺滅效果，不過無法完全清除增殖井不活躍的腫瘤干細胞，成為腫瘤復發(fā)的重要原因Todar。等“發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的白介素4(IL-4)是CD133一結直腸癌下細胞避免凋亡的重要細9}?因子在體外給予氟尿咭咤c5_I_I和奧沙利今Q;}W鐘瘤時發(fā)現(xiàn).對CD133一拙組有段好刃殺滅致果.而CD13一細袍能日分泌。

         4.增強井有十川范目之廳振}.i通過體外給予I1.-4抗體.發(fā)現(xiàn)}-FC和奧少利FLJj-n:0133-細咆的殺滅效果明顯增強，給NOD/SCID裸鼠神瘤漠型中注襯IL-4抗體發(fā)現(xiàn)，比單用化療藥有更強的腫有抑制作用，并顯著減少腫瘤組織中CD133+細胞的數(shù)量Loml,ard。等;

         5研究表明，促進腸道干細胞分化的成骨蛋白4(BMP4)亦能促進結直腸癌腫瘤干細胞的分化和凋亡，并通過PI3K/f1KT通路增加CSC對化療的敏感性嘆、結直腸癌干細胞研究面臨的問題和思考腫瘤十細胞研究目前還處于起步階段，面臨較多的問題和挑戰(zhàn)尋找到種瘤干細胞表面標志物是研究的基礎和關鍵。不過，各種腫瘤J二細飽的特異性標志物一自以來都有較大的爭議。鑒定腫瘤細胞是否為C:二金標佳”為移植成瘤實驗，根據(jù)細胞表面標志物分選細胞能夠重建腫瘤的細,;則被認為是腫瘤干細胞，不過這種檢測標準同樣存在較多爭議首先.;.于種藺差異性，腫瘤異種移植裸鼠并不能完全代表人體內(nèi)的生長環(huán)境能夠在裸鼠體內(nèi)致瘤的細胞亞群也許只是能夠在異種環(huán)境中有生存優(yōu)勢的細胞群體，而并不能礁定是(:SC;其次，在種瘤組織處理以及細胞分選的過程中，細報刃三存活力和表面標志物可能有所改變，引起了致瘤能力G墳夏:薄次，目前廣泛用于CSC研究的NOD/SCID鼠體內(nèi)仍維持有目然殺傷細胞的活性，而(}uintana等提出OD/SLID-1L2Pry裸鼠是一種比NOD/SC工D鼠更佳的腫瘤干細胞研究模型，體內(nèi)B細胞、T細胞和自然殺傷細胞缺失，有更強的腫瘤異種移植致瘤性。 對于腫瘤干細胞的治療，目前仍處于基礎研究階段，各種治療策略構想共同面臨的問題是如何特異性識別腫瘤干細胞而對正常組織細胞無害。由于特異性的腫瘤干細胞表面標志物并未發(fā)現(xiàn)，目前提出的治療方案對人體存在較大的風險。比如Hirsch等37}提出的通過靶向殺傷CD133'細胞以達到消滅腫瘤干細胞的目的。但是，Shmelkov等oe研究表明，CD133在人體正常腸道上皮細胞同樣廣泛表達，以CD133為細胞靶點治療腫瘤，明顯會對正常組織造成傷害。

         七、展望 腫瘤十細胞是當今腫瘤研究中的熱點問題，尤其是CSC的靶向治療能夠克服傳統(tǒng)化療和放療的盲目性，減少腫瘤的復發(fā)、耐藥和轉移。不過，由于目前實驗方法技術的限制，CSC以及特異性標志物存在較大爭議。如何建立可靠的動物模型、如何找到具有特異性的表面標志物和如何選擇性殺傷CSC而不損傷正常細胞，這些問題應該成為今后研究和努力的方向，從而進一步推動腫瘤的診斷、預防和治療.為腫瘤患者帶來福音。

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